[发明专利]采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法

说明书

本发明属于甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种采用生长细胞生物发酵麦角固醇制备中间体的方法。本发明包括以下步骤：(1)3位保护；(2)生长细胞转化；(3)提取；(4)水解；(5)精制。本发明的制备方法成本较低，路线更短，省掉了许多反应步骤和后处理步骤，反应路线的缩短也有利于反应收率的提高，减少中间损耗。本发明采取3位羟基保护的步骤在前，生长细胞生物发酵反应在后，直接加大了发酵底物在发酵液中的溶解度，有利于发酵的进行，可提高产物的收率，减少杂质的产生。本发明的制备方法还能减少化学试剂的使用，有利于环境保护。

技术领域

本发明属于甾体类药物中间体的生产方法，具体涉及一种采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法。

背景技术

中间体孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇的结构式如下式所示，该产品为甾体合成中重要的中间体，传统的制备方法中是使用3位酮基的类似结构，并使用化学方法选择性还原3位酮基为β羟基，但使用化学方法得到的产品常常带有一定量的3位α羟基异构体，且需要通过多步化学反应来完成，其中需用到多种价格贵且不利于环保的试剂，成本较高，同时收率低，产品质量差。

菌株Mycobacterium sp.B-NRRL 3683记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究是通过控制反应条件来提高4-AD和ADD的收率。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇的方法，能够解决该中间体合成过程中步骤复杂、易产生3位α羟基异构体杂质，且成本较高、收率较低的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体孕甾-5,7二烯-3β,21-二醇的方法，包括以下步骤：

(1)3位保护：利用甲缩醛作为保护剂，将麦角固醇的3位羟基进行保护，得到麦角固醇醚化物，反应过程中加入五氧化二磷作为催化剂和硅藻土作为助滤剂；

(2)生长细胞转化：将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)B-NRRL 3683诱变菌种经过斜面培养和种子培养后接种至转化培养基中，对步骤(1)得到的所述麦角固醇醚化物进行发酵转化；

(3)提取：转化结束后对步骤(2)所得的发酵产物进行提取，得到固体产物；

(4)水解：将步骤(3)所得的固体产物用乙酸乙酯溶解，搅拌后抽滤，合并滤液，减压浓缩后加入盐酸进行水解；

(5)精制：将步骤(4)所得的水解产物进行精制提纯。

进一步地，本发明的甲缩醛作为反应溶剂和反应剂，只要能保证反应的进行，反应剂的量没有特别要求，优选的甲缩醛与麦角固醇的质量比为3-20:1。

为了推动反应向正向进行，需要除去反应产生的甲醇和体系中少量的水分，因此需要加入催化剂五氧化二磷，五氧化二磷吸收甲醇或水分变成磷酸酯或磷酸，在甲缩醛中溶解度较低，呈油状物，可通过加入助滤剂吸附后过滤除去，助滤剂优选硅藻土。过滤剂和催化剂的加入量以能达到目的为标准，经过研究人员常规的实验即可得到，本发明优选的过滤剂加入量为麦角固醇重量的1倍，催化剂的加入量为麦角固醇重量的0.5倍。

进一步地，所述步骤(2)中B-NRRL 3683诱变菌种的制备方法为：

a.以分枝杆菌B-NRRL 3683为出发菌种，在加入2％质量比琼脂的M1固体培养基中斜面培养，将斜面种子接种于M1液体种子培养基中活化，30℃，200rpm 摇床振荡培养48h；取活化好的一级种子按体积比10％接入新的M1液体种子培养基中进行二级种子培养，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；