[发明专利]一种双重标记荧光微球的制备方法

说明书

本发明提供了一种双重标记荧光微球的制备方法，以苏丹红Ⅰ(AS)和铕(Eu)为荧光标记物，制备出具有双重标记的表面羧基功能化的荧光微球。微球在无激发光激发的状态下呈现橙黄色，而360nm紫外线激发下发出红色荧光。两种标记物分别可提供470nm处紫外吸收和615nm处荧光作为检测信号。通过控制两种标记物的含量，可以制备出双重信号标记功能的微球，在生物分子检测、药物筛选等领域提供帮助。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种双重标记荧光微球的制备方法。

背景技术

荧光微球在生命科学、医学等领域得到广泛的应用，如抗原检测，为抗原分型、药物筛选，等高通量检测。但是传统的有机荧光分子由于荧光发射峰宽而不对称，不同荧光分子之间易因发射峰重叠而造成干扰，一定程度上限制了荧光微球的应用。虽然现在也有技术将部分稀土元素作为荧光分子，具有荧光量子产率高、发射峰窄、荧光寿命长等优点，但是由于掺杂多种稀土配合物而造成各荧光信号减弱。

为了进一步增加荧光微球的可编码范围，同时减少稀土造成的荧光信号减弱影响，我们提供一种新的方案为荧光标记物，制备这种双重标记的荧光微球。

发明内容

本发明目的是提供一种双重标记荧光微球的制备方法，可以制备出双重信号标记功能的微球，在生物分子检测、药物筛选等领域提供帮助。

为解决上述问题，本发明提供一种双重标记荧光微球的制备方法，包括：

将苯乙烯放入带机械搅拌器的三口瓶中，然后加入水，加热搅拌；水浴升温至大于等于70℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球；将聚苯乙烯微球离心收集，超纯水清洗并超声重悬水中。

将领苯二甲酸正丁酯与的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在水浴中搅拌溶胀；然后把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀；混合液搅拌升温，加入过硫酸铵溶液，聚合，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。

在聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，称取铕配合物，溶于苯乙烯中，并加入聚苯乙烯微球悬浮液；超声乳化后，避光机械搅拌；升温，加入过硫酸铵进行聚合反应；反应一段时间后，补加苯乙烯和甲基丙烯酸，继续反应，结束反应后离心收集产物，洗涤，即为羧基荧光微球；加入甲基丙烯酸，微球表面被羧基化，使微球能与生物分子偶联；以及

取聚苯乙烯微球悬浮液加入NaOH溶液中和微球表面羧基，使其pH大于10，在磁力搅拌下用HCl溶液返滴定，直到样品的pH为3结束，计算微球表面羧基含量。

可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，将1～50mL苯乙烯放入带机械搅拌器的500mL三口瓶中，然后加入100～300mL水，通入氮气加热搅拌；水浴升温至75℃时，加入过硫酸铵溶液，继续搅拌反应20h，得到均一的白色乳液即为聚苯乙烯微球。

可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，将领苯二甲酸正丁酯与0.25％的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声至均匀乳液，将聚苯乙烯种子微球置于乳液中在20℃～40℃水浴中搅拌溶胀24h。

可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，把含有苯乙烯、二乙烯基苯、可聚合染料单体苏丹红Ⅰ的乳液加到种子悬浮液中，搅拌溶胀24h。

可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，混合液在氮气保护下搅拌升温至75℃，温度稳定后，加入过硫酸铵溶液，聚合24h，产物通过离心收集并用乙醇和水清洗。

可选的，对于所述的双重标记荧光微球的制备方法，在浓度为20mg/mL的聚苯乙烯微球乳液中加入十二烷基磺酸钠水溶液，使其终浓度为0.25％。