[发明专利]一种提高细胞脂质体转染效率的方法

说明书

本发明提供了一种提高细胞脂质体转染效率的方法，其特征包含如下步骤：1)将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含乙草胺0.01‑1μM，氯化钙0.1‑50μM，胆固醇.0.1‑3μM；2)：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。本发明中公开的方法可以显著提高各种细胞，尤其是悬浮培养细胞的脂质体转染效率，缩短了细胞的培养时间及节省了转染试剂。

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，更特别地，涉及一种脂质体介导的细胞转染方法。

背景技术

转染是将外源遗传物质转入到真核细胞内的一种专门技术，随着基因与蛋白功能研究的深入，转染已成为现代分子生物学研究中经常涉及的基本方法，它解决了外源遗传物质导入细胞的难题，为在细胞水平上进行基因功能研究奠定了基础。随着近年来基因工程技术的不断发展，出现了多种多样的转染技术。一般的转染方法多采用脂质体法和电穿孔的方法。阳离子脂质体表面带正电荷，与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹成DNA-脂质体复合物，能吸附在表面带负电荷的细胞膜，通过膜的融合或细胞内吞作用进入细胞体内。有时也通过细胞膜上小孔的直接渗透作用将DNA传递进入细胞。电穿孔法或电转法，是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而将外源分子，如DNA、mRNA、蛋白、糖类等送入宿主细胞的胞浆内。但是对于很多细胞株或原代细胞，外源DNA通过非病毒载体方法进入细胞后并未能完全转录翻译成目的蛋白，表达效率较低，常常达不到实验要求。而通过电击法和病毒法进行转染的效率也不高，且实验操作过程麻烦。如何提高外源DNA在细胞内的表达成为了一个技术难题。病毒法对原代细胞进行感染时，往往需要较高的病毒滴度且通常效果不甚理想。而电穿孔的方法在操作简易度和实验周期上相比病毒法感染原代细胞更具优势。然而，该法的普及受制于电转效率、细胞存活率、实验仪器差异等诸多因素。加之原代细胞对于多种转染方法都具有较强的抵抗性，使得关于细胞进行高效基因编辑的手段较为匮乏

阳离子脂质体通常包括：阳离子头部，疏水锚定区以及两者间的链接部分。带正电荷的头部对于与核酸的磷酸骨架的结合是至关重要的。疏水锚定区参与形成支架，以帮助完成内吞作用或与细胞膜融合。新合成的脂质体都有新的分子结构，有更高的转染效率及更低的毒性。进一步了解转染的机制，可以帮助我们更好的理解结构与活性的关系。阳离子脂质体通过静电作用与核酸结合后，通过疏水作用，使核酸压缩为聚合物。细胞内吞后，这种聚合物可保护核酸免受核酸酶的降解。当其进入细胞核后，通过生理的刺激，例如酶的活化，pH值的变化等等，而使脂质体极性头部的二硫键断裂，释放DNA，完成转染。由于不同类型的细胞有不同的膜成分，所以不同类型的细胞需要使用不同的脂质体进行转染。尽管在阳离子脂质体研发领域取得长足进展，但仍需要对其进行不断改善。

目前市场上常见的转染试剂的转染效率较低，尤其对于悬浮细胞，其转染效率更低，同时价格昂贵。因此，市场上急需一种转染效率更高且价格便宜，适合于国内大多数实验室使用转染试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供新型高效的脂质体转染方法，为了实现上述目的，本技术方案包含如下步骤：

1)将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含乙草胺0.01-1μM，氯化钙0.1-50μM，胆固醇.0.1-3μM；

2)：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。

所述步骤1)中液体培养基含有乙草胺、氯化钙或者胆固醇中的一种或一种以上物质。

所述步骤1)中液体培养基含有的的最佳浓度为乙草胺浓度0.03μM、氯化钙25μM、胆固醇0.5μM。

所述步骤2)具体包括：

a：将所述转染DNA与脂质体转染试剂混匀，于室温下静置20分钟，得到转染DNA与脂质体转染试剂的混合液；