[发明专利]一种精确检测发酵液中丁二胺含量的方法

说明书

本发明公开了一种精确检测发酵液中丁二胺含量的方法，属于生物工程检测领域。本发明是针对发酵液这一复杂体系，基于内标的添加以及校准曲线的校准，对现有生物胺检测方法进行了优化与改进，实现了发酵液中丁二胺的准确定量，相对误差在5.40％％以内。这种校准方法消除了复杂体系对丁二胺检测的干扰，解决了丁二胺生物合成过程中检测困难的问题，为实现生物法生产丁二胺的工业化进程奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种精确检测发酵液中丁二胺含量的方法，属于生物工程检测领域。

背景技术

丁二胺，又称腐胺或1,4-二氨基丁烷，是一种工业价值很高的二元胺，可应用于塑料、药物、农用化学品和表面活性剂等的工业生产中。丁二胺作为单体与己二酸共聚生产的尼龙 4,6是一种高性能聚酰胺材料，因其具有高熔点、高机械强度和优异的耐溶剂性等优点被广泛应用于工业机械、汽车制造、航空航天、电子配件、纺织品和服装等领域。

目前工业上普遍采用化学方法生产丁二胺，该方法需要使用不可持续的石油原料、昂贵的催化剂，并且反应过程具有易燃易爆等安全隐患，这限制了丁二胺的进一步工业化应用。针对上述问题，丁二胺的生物合成法成为了一个有效的选择。但复杂的发酵液体系给生物法生产丁二胺的精确检测造成了一定困难，如何检测发酵液中的丁二胺含量以及评价工程菌的丁二胺生产能力是目前生物合成丁二胺研究中亟待解决的瓶颈问题之一。

当前，薄层色谱(TLC)，离子色谱(IC)，气相色谱(GC)以及高效液相色谱法(HPLC)普遍用于丁二胺含量的检测，在这其中，HPLC应用最为广泛。由于丁二胺缺乏紫外吸收或荧光发色团，不能通过紫外或荧光检测器直接检测，因此，在HPLC之前通常先对生物胺进行衍生化。丁二胺的丹黄酰氯衍生物相对稳定，可以在4℃下至少保存1周，常用于丁二胺的HPLC检测。而发酵液体系中含有的培养基成分以及各种菌体合成的蛋白质、多肽、氨基酸等物质，大部分能与丹磺酰氯反应，干扰丁二胺的定量检测，使检测值显著低于其实际含量。此外，在发酵过程中，发酵液体系中各物质的浓度也在时刻处于动态变化中，这种变化给丁二胺的定量检测带来了困难。因此，如何定量检测发酵液中的丁二胺成为了限制丁二胺生物法合成的关键。

研究发现，发酵培养基中酵母粉含量对丁二胺准确检测的影响最为明显，当体系中存在大量酵母粉时，通过HPLC方法检测得到的丁二胺含量会显著低于其实际含量。此外，同一培养基体系对丁二胺结构相似物质的检测存在着程度不同但规律类似的影响：1,7-庚二胺和 1,6-己二胺受酵母粉的影响规律与丁二胺相同，也存在检测得到的浓度低于实际浓度的情况。

发明内容

针对上述问题，本发明创新性地提出了一种全新的检测思路：即利用发酵液对内标的干扰效果来指示其对丁二胺的干扰，以减小检测方法的误差，实现复杂体系中丁二胺的精确检测。

本发明的第一个目的是提供了一种精确检测发酵液中丁二胺含量的方法，是以1,7-庚二胺和/或1,6-己二胺二盐酸盐为内标物，对加入内标物的发酵液进行HPLC检测，用校准模型对检测结果校准，计得到丁二胺含量；

所述校准模型为：其中，K：转换系数，A₁：丁二胺衍生物峰面积，T₁：发酵液体系中丁二胺浓度，A₂：内标衍生物峰面积，T₂：内标浓度。

在一种实施方式中，所述转换系数是以发酵液中的干扰物浓度为参比，计算获得。

在一种实施方式中，所述干扰物为酵母提取物，含有多肽或氨基酸。

在一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)建立模拟丁二胺发酵液体系：SOB培养基为基础体系加入不同浓度的酵母提取物，建立不同的发酵培养基体系，然后向已建立的不同的发酵培养基中加入丁二胺标准品，得到不同浓度的模拟丁二胺发酵液体系；