[发明专利]基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法

权利要求书

1.一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，利用沙门氏菌保守的毒力蛋白PagN制备多克隆抗体，采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠捕获沙门氏菌，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测。

2.根据权利要求1所述基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)根据Genbank查找沙门氏菌PagN毒力基因，去掉其跨膜域设计引物，上游引物为：

5‘-AAAGAAGGGGCCTATATCACCG-3’(SEQ ID No.1)，下游引物为：

5‘-TTAAAATGCGTAAGTGATGCC-3’(SEQ ID No.2)，PCR扩增出长为657bp的DNA片段；

(2)构建pET-28a-PagN原核表达载体，表达纯化原核重组蛋白，以1mg/mL蛋白量免疫兔子三次得到抗PagN兔血清，饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化多克隆抗体；

(3)磁力架的制作，用于富集免疫磁珠；

(4)PagN免疫磁珠制备：在羧基化磁珠表面偶联PagN多克隆抗体，加入终浓度10mg/mL的偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)，1％牛血清白蛋白进行封闭；

(5)免疫磁珠捕获沙门氏菌效率优化，摸索最佳捕获时间、捕获温度、免疫磁珠与多克隆抗体用量、沙门氏菌最适浓度；

(6)免疫磁珠富集沙门氏菌：取制备的PagN免疫磁珠0.2mg,与合适稀释度的沙门氏菌待测液1mL,室温孵育50min,磁力架回收磁珠分离3-5min，分别取捕获前后上清液进行活菌计数，计算捕获效率；

(7)荧光定量标准曲线的建立，选取沙门氏菌灵敏度较高的invA基因作为检测引物，上游引物为：5‘-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为：

5‘-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3’(SEQ ID No.4)；

(8)IMBs-qPCR联用检测食品中沙门氏菌：牛奶、猪肉样品预增菌进行PagN免疫磁珠捕获，磁力架吸附磁珠，上清液用于活菌计数，免疫磁珠复合物提基因组DNA用于qPCR检测，检测免疫磁珠捕获效率。

3.根据权利要求1所述基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤(5)捕获沙门氏菌效率优化参数为：30μL PagN多克隆抗体与2mg免疫磁珠偶联4h，沙门氏菌浓度10²-10⁵CFU/mL。