[发明专利]基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，利用沙门氏菌保守的毒力基因PagN制备多克隆抗体与羧基化磁珠偶联构建免疫磁珠，与荧光定量PCR检测方法联用，避免了传统培养法中复杂耗时等问题，此方法快速有效、成本经济，即时可见，可以实现特异性检测与定量食品中的沙门氏菌。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及食源性致病菌--沙门氏菌的检测。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella sp.)是一种能够引起人兽共患，寄生于动物和人类肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科，1885年Salmon在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，至今为止沙门氏菌共具有六种肠道亚型，已发现有2600多种肠道血清型，最常见的血清型为肠道沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱杆菌等，饮食如猪肉、牛奶等是感染沙门氏菌的常见途径，感染沙门氏菌的食物口服后经口腔进入体内，后经淋巴系统进入血液，其对入侵的沙门氏菌发生抵御，菌体被破坏并释放内毒素，对细胞和组织产生一系列感染，主要感染症状为持续发热、腹泻、呕吐等，严重可引起伤寒、菌血症和全身感染。在我国食源性疾病中分离出病原体沙门氏菌的检出率一直高居不下，在美国每年约有150万人感染死亡比例高达39％，在越南肉食类食物中沙门氏菌检出率约为41.1％，因此沙门氏菌成为全球公共卫生问题。

世界卫生组织也已将沙门氏菌的检验列为必不可少的检测指标，相关技术发展迅速，传统培养法是目前大多数国家检测沙门菌的基本手段，通过选择性增菌进行分离及生化鉴定，但其培养过程过于复杂耗时；分子生物学方法从核酸水平实现对病原体的检测，其具有较高的准确性和灵敏度，如基因芯片技术、基因探针、聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction，PCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等；免疫学检测技术近几年被应用广泛，利用抗原抗体的特异性结合实现病原体的快速检测，例如酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)、免疫胶体金技术、免疫磁珠分离技术(immunomagneticbead separation technology,IMB)等。但目前的检测技术存在检出限不高、检测时间冗长的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，解决现有技术中检出限不高、时间冗长，弥补单一检测技术不足等问题。

本发明的技术方案包括：

一种基于PagN基因快速检测食源性沙门氏菌的方法，利用沙门氏菌保守的毒力蛋白PagN制备多克隆抗体，采用羧基化磁珠与制备的PagN多克隆抗体偶联形成免疫磁珠捕获沙门氏菌，形成免疫磁珠-沙门氏菌复合物，收集的磁珠复合物提取基因组DNA用于荧光定量PCR检测。

具体包括以下步骤：

(1)根据Genbank查找沙门氏菌PagN毒力基因，去掉其跨膜域设计引物，上游引物为：5‘-AAAGAAGGGGCCTATATCACCG-3’(SEQ ID No.1)，下游引物为：5‘-TTAAAATGCGTAAGTGATGCC-3’(SEQ ID No.2)，PCR扩增出长为657bp的DNA片段；

(2)构建pET-28a-PagN原核表达载体，表达纯化原核重组蛋白，以1mg/mL蛋白量免疫兔子三次得到抗PagN兔血清，饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化多克隆抗体；

(3)磁力架的制作，用于富集免疫磁珠；

(4)PagN免疫磁珠制备：在羧基化磁珠表面偶联PagN多克隆抗体，加入终浓度10mg/mL的偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)，1％牛血清白蛋白进行封闭；