[发明专利]一种快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)qPCR引物设计：选择小肠结炎耶尔森菌foxA位点为靶基，并且基于在线软件设计引物；foxA的上游引物：5’-CATCCCTGGTGGTGTAGTA-3’，foxA的下游引物：5’-GTTCAGATATCGCATCGGTATAA-3’；

(2)表达外膜蛋白，制备特异性抗体：选择小肠结炎耶尔森菌外膜蛋白OmpF作为抗原蛋白，将小肠结炎耶尔森菌外膜蛋白OmpF表达纯化后，对成年兔子进行多次免疫，制备OmpF抗血清；接着用饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化OmpF抗体，分装放置于保存备用；

(3)免疫磁珠的制备：将OmpF抗体与羧基修饰的磁珠偶联，依次加入碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺，经洗涤后逐滴加入OmpF抗体交联，用牛血清白蛋白进行封闭后加入保存液分装备用；

(4)食品样本预处理：无菌操作取检样至装有改良磷酸盐缓冲液的锥形瓶中，在充分增菌后加入OmpF免疫磁珠，用磁力架吸附后，将上清用于平板计数，免疫磁珠复合物用于后续细菌基因组的提取；

(5)细菌基因组的提取：将步骤(4)所得磁珠重旋液离心，将上清弃去；按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书步骤提取细菌DNA，获得所需要的模板；

(6)实时荧光定量PCR检测：荧光定量PCR反应体系为：2×TransStart Tip Green qPCRSuperMix 10μL，Primer F(10μM)、Primer R(10μM)各0.4μL，细菌DNA模板2μL，加入dd H₂O补齐至20μL；荧光定量PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性10s，54℃退火30s，70℃延伸20s，共40个循环；

(7)对荧光定量PCR结果判定：将步骤(6)所得的荧光定量PCR结果代入到标准曲线中，可以定量检测食品中的小肠结炎耶尔森菌。

2.根据权利要求1所述快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，其特征在于，所述步骤(3)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺终浓度为10mg/mL，OmpF抗体浓度为10mg/mL，牛血清白蛋白浓度为1％。

3.根据权利要求1所述快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，其特征在于，所述步骤(5)磁珠重旋液以12000r/min离心两分钟。

4.根据权利要求1所述快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，其特征在于，所述步骤(7)标准曲线为y＝-3.46x+41.01，其中y为Ct值，X为细菌浓度的对数。