[发明专利]一种快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，包括以下步骤：步骤一、qPCR引物设计；步骤二、表达外膜蛋白，制备特异性抗体；步骤三、制备免疫磁珠；步骤四、预处理食品样本；步骤五、提取细菌基因组；步骤六、利用实时荧光定量qPCR检测；步骤七、对实时荧光定量qPCR结果判定。本发明方法十分快捷，特异性较高，适用范围广泛，适合在实际生产中推广使用。

技术领域

本发明涉及了一种快速定量检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，尤其涉及一种基于IMBs-qPCR快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的检测方法。

背景技术

小肠结炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)是一种重要的人畜共患病原菌，不仅可以引起肠道疾病，还可以引起关节炎、肠系膜淋巴结炎等肠道外综合症，对人类的健康构成了严重的威胁。小肠结炎耶尔森菌分布很广，在饮用水、食品和土壤中均能繁殖，并且在人群中传播，造成疫情。目前我国针对小肠结炎耶尔森菌的检测方式是培养法，但是检测步骤十分繁琐，检测周期长，具有一定的局限性。为了保证居民的食品安全，急需一种快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法。

免疫磁珠分离技术(Imunomagic beads separation techniques,IMBs)是一种简单、高效的样品处理方式。其基本原理是利用抗体与磁珠表面的活性基团的偶联，当目的抗原与磁珠上的抗体结合后，在外加磁场的作用下，将捕获的抗原与其他杂质分开。因为免疫磁珠分离技术具有很高特异性以及将抗原富集的特点，该技术广泛应用于细菌检测的预处理过程。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技术是一种先进的核酸诊断技术，广泛应用于食品与环境安全、医学诊断等领域。qPCR技术具有多种荧光化学方法，其中SYBR荧光染料法是一种最为常见的方法。其基本原理是在PCR的过程中加入过量的SYBR荧光染料，荧光染料可以和DNA双链结合，发出荧光被检测系统收集。因为SYBR荧光染料法具有成本较低、操作便捷的特点，所以被广泛应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种基于IMBs-qPCR技术，快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，解决目前检测技术的检测周期长、检测准确率低等问题。

本发明的技术方案为：

一种快速检测食品中小肠结炎耶尔森菌的方法，包括以下步骤：

(1)qPCR引物设计：选择小肠结炎耶尔森菌foxA位点为靶基，并且基于在线软件设计引物；foxA的上游引物：5’-CATCCCTGGTGGTGTAGTA-3’，foxA的下游引物：5’-GTTCAGATATCGCATCGGTATAA-3’；

(2)表达外膜蛋白，制备特异性抗体：选择小肠结炎耶尔森菌外膜蛋白OmpF作为抗原蛋白，将小肠结炎耶尔森菌外膜蛋白OmpF表达纯化后，对成年兔子进行多次免疫，制备OmpF抗血清；接着用饱和硫酸铵(SAS)沉淀法纯化OmpF抗体，分装放置于保存备用；

(3)免疫磁珠的制备：将OmpF抗体与羧基修饰的磁珠偶联，依次加入碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺，经洗涤后逐滴加入OmpF抗体交联，用牛血清白蛋白进行封闭后加入保存液分装备用；

(4)食品样本预处理：无菌操作取检样至装有改良磷酸盐缓冲液的锥形瓶中，在充分增菌后加入OmpF免疫磁珠，用磁力架吸附后，将上清用于平板计数，免疫磁珠复合物用于后续细菌基因组的提取；

(5)细菌基因组的提取：将步骤(4)所得磁珠重旋液离心，将上清弃去；按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书步骤提取细菌DNA，获得所需要的模板；