[发明专利]用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、RPA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物，其特征在于：所述的RPA引物是基于单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因设计的，其引物序列如下：

上游引物hlyAI-F：5’-CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTG-3’；

下游引物hlyAI-R：3’-TTGTTGTATAGGCAATGGGAACTCCTGGTG-5’。

2.一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA试剂盒，其特征在于包括RPA反应扩增体系：上游引物hlyAI-F、下游引物hlyAI-R、冻干酶粉、再水化缓冲液和醋酸镁溶液，所述的上游引物hlyAI-F的序列如下： 5’-CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTG-3’； 所述的下游引物hlyAI-R的序列如下：3’-TTGTTGTATAGGCAATGGGAACTCCTGGTG-5’。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA试剂盒，其特征在于所述的RPA反应扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液29.5μL、去离子水12.5μL、终浓度均为0.4μmol/L的上、下游引物各2μL，DNA模板50ng，最后再加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL。

4.一种利用权利要求2或3所述的试剂盒检测单核细胞增生李斯特菌的RPA方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）RPA扩增

以待测菌株的DNA为模板，采用hlyAI-F和hlyAI-R引物进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物；

（2）RPA扩增产物的电泳检测

向上述RPA扩增产物中加入50μL由苯酚和氯仿按体积比1:1混合而成的溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5wt％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA扩增产物进行测序，若RPA扩增得到的扩增产物含有大小为216bp的片段，则所述待测病原菌为单增李斯特菌或待测食品中感染单增李斯特菌。

5.根据权利要求4所述的用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA方法，其特征在于所述的RPA扩增体系的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管中加入再水化缓冲液29.5μL、去离子水12.5μL、终浓度均为0.4μmol/L的上、下游引物各2μL，DNA模板50ng，最后再加入280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μL。

6.根据权利要求4所述的用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA方法，其特征在于所述的RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。