[发明专利]用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、RPA试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、RPA试剂盒及其应用，特点是RPA引物是基于单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因设计的，其引物序列如下：上游引物hlyAI‑F：5’‑CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTG‑3’；下游引物hlyAI‑R：3’‑TTGTTGTATAGGCAATGGGAACTCCTGGTG‑5’；其RPA试剂盒包括RPA反应扩增体系：上游引物hlyAI‑F、下游引物hlyAI‑R、冻干酶粉、再水化缓冲液和醋酸镁溶液，优点是特异性强、灵敏度高以及检测时间短。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、RPA试剂盒及其应用。

背景技术

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是李斯特菌属中致病力最强的食源性致病菌，也是一种人畜共患病原菌。该菌分布广泛，据报道，4-8%的水产品，5-10%的乳及其产品，30%以上的肉制品及15%以上的家禽可被该菌污染，而且即食食品和冷藏冷冻食品也易受到污染。人感染该病菌后，会出现败血症、脑膜炎、胃肠炎等症状，尤以妊娠期妇女、新生儿以及免疫功能低下的病人更易感染，死亡率达30%以上。2000年WHO食品安全工作计划把该菌列为食源性致病菌之一。美国对该菌实行“零容忍”，要求食品中不能检出；加拿大对该菌的最大允许量是100 CFU/g；我国要求食品中不得检出该菌。近年来，我国建立了全国食品污染物监测网和食源性疾病监测网，重点监测该菌。

国际上公认的李斯特菌属除单增李斯特菌，还有5种：绵羊李斯特菌（L.ivanovii）、英诺克李斯特菌（L. innocua）、威尔李斯特菌（L. welshimeri）、格氏李斯特菌（L. grayi）和西尔李斯特菌（L. seeligeri）。常见的单增李斯特菌及李斯特菌属的检测方法中，分离培养鉴定方法原理比较简单，但操作繁琐、耗时长，不适合食品的快速检测，而且采用国标法检测单增李斯特菌，英诺克李斯特菌常常伴随该菌而出现，且检出率比该菌高，并影响检测结果，容易造成假阴性出现。由于6种李斯特菌表现型的相似性，传统生化反应不易用于李斯特菌的种间区分。还有溶血试验、协同溶血试验等方法。但上述方法对实验设备要求不高、周期长。鉴于此，需要找到一种简便、快速、准确的方法用于单增李斯特菌的快速检测。RPA(Recombinase polymerase amplifcation)是一项新型的等温扩增技术，对设备要求简单、对温度要求不严苛，在37-42℃条件下，15～20分钟内即可快速检测待测目标基因片段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高以及检测时间短的用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物、RPA试剂盒及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA引物，所述的RPA引物是基于单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因设计的，其引物序列如下：

上游引物hlyAI-F：5’-CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTG-3’；

下游引物hlyAI-R：3’-TTGTTGTATAGGCAATGGGAACTCCTGGTG-5’。

2、一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的RPA试剂盒，包括RPA反应扩增体系：上游引物hlyAI-F、下游引物hlyAI-R、冻干酶粉、再水化缓冲液和醋酸镁溶液，所述的上游引物hlyAI-F的序列如下： 5’-CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTG-3’； 所述的下游引物hlyAI-R的序列如下：3’-TTGTTGTATAGGCAATGGGAACTCCTGGTG-5’。