[发明专利]测序内标分子及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种测序内标分子及其制备方法和应用，属于基因检测技术领域。该测序内标分子的制备方法包括以下步骤：S1：以1000±200bp为窗口，获得与待测样本中基因序列非同源的unique植源性序列；S2：挑选出GC含量为35％‑70％的序列；S3：筛选出无微卫星的序列；S4：筛选出连续碱基序列数小于8的序列；S5：以测序读长±5bp为窗口进行两两比对，对筛选出的序列做同源性筛查，获得序列相似性低的序列，即为筛选序列；S6：以所述筛选序列为内标分子的基础序列进行PCR扩增，即得获得测序内标分子。上述测序内标分子经过严格的系统筛选后得出，不仅具有较低的成本，还能够在跟踪样本和监控样品间交叉污染的同时不影响病原微生物的检出和测序数据量。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种测序内标分子及其制备方法和应用。

背景技术

二代测序(又称下一代测序，NGS)技术在发现和转化研究的诸多方面已逐渐成为一种被广泛采用的技术，二代测序由于无偏倚性和高通量的特点，在急难危重感染性疾病的病原检测分析中有重要应用，且能够同时对多个样本进行测序。而在同时进行建库操作的过程中，因操作失误、气溶胶或index hopping导致的同批次样本的互换或交叉污染对检测结果有很大的误导性，而样品跟踪和样本间交叉污染监控的方法就是运用内标分子掺入(unique molecule spike-in，UMSI)进行实现。

对于内标分子，目前大多采用化学合成自然界不存在的序列作为内标分子，但是化学合成序列成本高，在进行大规模样本建库测序的时候就需要更多数量的内标分子。并且，内标分子必须参与建库全程，对于不同的样本类型，需考虑不同的掺入量，掺入量太低，不能起到监测污染的功能；掺入量太高，则成本增加，降低有效数据量。而对于宏转录组检测，内标分子需以RNA形式掺入，合成单链RNA成本更高。

发明内容

基于此，有必要针对上述化学合成内标分子成本高的问题，提供一种测序内标分子及其制备方法和应用，这些内标分子经过严格的系统筛选后得出，不仅具有较低的成本，还能够在样品跟踪及样本间交叉污染监控的同时不影响病原微生物的检出和测序数据量。

一种测序内标分子的制备方法，包括以下步骤：

S1：以1000±200bp为窗口，获得与待测样本中基因序列非同源的unique植源性序列；

S2：从上述unique植源性序列中挑选出GC含量为35％-70％的序列；

S3：从上述序列中筛选出无微卫星的序列；

S4：从上述序列中筛选出连续碱基序列数小于8的序列；

S5：在上述序列中，以测序读长±5bp为窗口进行两两比对，对筛选出的序列做同源性筛查，获得序列相似性低的序列，即为筛选序列；

S6：以所述筛选序列为内标分子的基础序列，设计合成扩增引物，以所述植源性基因组为模板，进行PCR扩增，即得测序内标分子。

上述测序内标分子的制备方法，包括序列筛选和扩增两部分，在序列筛选中，考虑到大部分临床检测的目标主要是针对人源和微生物基因组特异序列进行鉴定，因此，选择植物源性核酸序列作为内标分子的来源。且植物源性基因组中包含叶绿素、光合作用、花和果实的特殊基因序列，可获得大量与人和微生物无同源性的序列。

在上述基础上，本发明人对植源性的序列进行了筛选，首先将植源性基因组序列分割为1000±200bp的序列集，便于后续使用PCR方法获得片段序列；对上述分割获得的序列集与本地数据库中人和微生物的序列进行比对，获得无同源性的序列集；对无同源性序列集进行GC含量过滤，挑选出GC含量为35％-70％的序列集；对符合GC含量的序列集进行微卫星过滤，剔除含微卫星的序列；后续进行连续碱基的过滤，筛选出连续碱基序列数小于8的序列集；对经过系列严格筛选后获得的序列集进行两两比对，获得低同源性的唯一序列集，作为内标分子序列集。