[发明专利]一种高产脂肪酸的制备方法及破囊壶菌培养基

权利要求书

1.一种高产脂肪酸的破囊壶菌培养基，其特征在于，成分及比例如下所示：Glycerol35-65g/l，Peptone 2-8g/l，磷酸二氢钾0.2-1g/l，海盐25-35g/l。

2.一种高产脂肪酸的制备方法，采用如权利要求1所述的培养基，其特征在于，主要步骤如下：

1)破囊壶菌高产脂肪酸液体培养基MPqd的制备:

在自然pH条件下，加超纯水1L，超声5-10min，用玻璃棒搅拌均匀，分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，于高压蒸汽灭菌锅中115℃，灭菌21分钟，冷却即得所需培养液；

2)破囊壶菌液体培养基MP的制备；

3)破囊壶菌固体培养基MP的制备；

4)破囊壶菌的活化：

在无菌条件下，用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于MP固体培养基中，然后在培养基中三区划线，培养箱中26±2℃培养1-3天即可；

5)破囊壶菌种子液的制备：

将纯化好的破囊壶菌固体培养基从培养箱中取出，在无菌操作台中用接种环挑取适量的破囊壶菌单菌落于制备好的上述MP液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养1-2天，即得所需种子液；

6)破囊壶菌发酵培养基的制备：

在超净工作台中用移液枪吸取上述破囊壶菌种子液2.5-5ml置于步骤1)中的MPqd破囊壶菌液体培养基中，于摇床中180rpm，26±2℃培养4天，即得所需的破囊壶菌发酵液。

3.根据权利要求2所述的一种高产脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述破囊壶菌液体培养基MP的制备步骤具体为：利用Glucose 10-20g/l，Yeast extract powder 1-2g/l，Peptone1.5-2.5g/l，磷酸二氢钾0.1-0.3g/l，海盐25-35g/l自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，冷却后即得所需液体培养基。

4.根据权利要求2所述的一种高产脂肪酸的制备方法，其特征在于，所述破囊壶菌固体培养基MP的制备步骤具体为：利用Glucose 10-20g/l，Yeast extract powder 1-2g/l，Peptone1.5-2.5g/l，磷酸二氢钾0.1-0.3g/l，海盐25-35g/l，琼脂粉15-20g，自然pH，加超纯水1L，超声5min，搅拌均匀后分装在100ml的无菌的锥形瓶中，每瓶加液体培养基50ml，115℃，灭菌21分钟，将灭过菌的培养基倒入无菌培养皿，待到冷却之后即可得到所需固体培养基。

5.根据权利要求2所述的一种高产脂肪酸的制备方法，其特征在于，破囊壶菌生物量的测定步骤：吸取10-30ml的破囊壶菌菌液于50ml的离心管中，4℃，8000rpm离心10-20min，将上层液体倒掉，下层菌体用10-30ml的无菌蒸馏水清洗3次，于冻干机中冷冻干燥36h，称重后即可计算生物量。

6.根据权利要求2所述的一种高产脂肪酸的制备方法，其特征在于，破囊壶菌脂肪酸的测定步骤：取冻干的菌体(确保无水分)，然后加入2ml 4％的硫酸甲醇溶液，再加入100μ1g/l的十九烷酸，震荡30s-60s后，在水浴锅中经80℃水浴1h后，冷却至室温，然后向离心管中加入1ml ddH₂O，1ml正己烷，震荡1-2min使其充分溶解28℃，6000rpm离心5-10min，溶液分层后，上层液体即为含有脂肪酸甲酯的正己烷溶液，用0.45μm的有机滤头过滤脂肪酸甲酯的正己烷溶液，然后用气象色谱仪测定滤液中各脂肪酸成分的含量，根据标液量计算各脂肪酸成分的含量。