[发明专利]一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用

说明书

本发明提供了一株低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其应用，该葡萄汁酵母菌株在部分敲除编码α‑乙酰乳酸合成酶的ILV2基因后，可以同时降低双乙酰和高级醇含量，联合二羟异戊酸脱水酶和羟酸还原异构酶过表达后，在发酵中对降低葡萄酒中的双乙酰含量有协同作用。利用该菌株发酵，提高了葡萄酒的风味质量，可酿造出风味优良且更有利于健康的葡萄酒。

技术领域：

本发明属于生物工程和基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种及其应用，具体是涉及一种低产双乙酰和高级醇的葡萄汁酵母菌株及其在制备葡萄酒中的应用。

背景技术：

葡萄酒是世界上最古老的具有浓厚文化底蕴的绿色保健饮料，也是现代生活中不可或缺的饮品。葡萄酒中的香气成分复杂多样，相对含量从每升几纳克到几百毫克不等，在葡萄酒的呈香过程中起到重要作用。双乙酰是葡萄酒中重要的风味物质，适量的双乙酰，会增加葡萄酒的香气，改善葡萄酒的风味，而当双乙酰含量过高时，就可能产生令人生厌的“馊饭味”，葡萄酒表现变质迹象。

高级醇味道大多似酒精，持续的时间长，有后劲，在葡萄酒中高级醇和其它风味物质以一定的比例共存于酒体中，互相配合、补充、衬托和制约。适量的高级醇和协调的组分比可以使酒的口感协调、柔和。高级醇含量过高会使酒产生异杂味，影响酒的风味和品质。另外，高级醇在人体内的氧化速度比乙醇慢，停留时间较乙醇长，其对人体的毒害作用远远高于乙醇。因此，葡萄酒中的双乙酰和高级醇的含量必须控制在合适的范围内。

目前对于双乙酰调控的研究主要集中在啤酒发酵过程中。啤酒中的双乙酰主要是由啤酒酵母细胞通过缬氨酸代谢途径产生的α-乙酰乳酸(α-Acetolactate)分泌至细胞外，再经过非酶促的氧化脱羧反应合成的。α-乙酰乳酸由丙酮酸生成，关键酶是乙酰乳酸合成酶，该酶的编码基因是ILV2，去除或改变ILV2，可减少α-乙酰乳酸的生成，从而减少双乙酰的生成。刘光诚等人发明了七日酿酒法，即在糖化和发酵过程中加入具有超强的电子还原性和离子交换功能的陨水速成剂，大幅降低了双乙酰指标，改善啤酒的品质(中国专利，CN107619733A，2018-01-23)。赵云财等人制作一种富含α-氨基氮的啤酒专用麦芽糖浆，并用该麦芽糖浆作辅料生产啤酒，可以大幅度降低双乙酰含量，提高啤酒的非生物稳定性(中国专利，CN103571672A，2014-02-12)。李红等人采用含有适当浓度D-缬氨酸的13°P麦汁在适当条件下驯化酵母，从酵母泥中筛选出对D-Val敏感的菌株并进行发酵实验，检测敏感菌株双乙酰含量，其降低率可达到34.08％(中国专利，CN104877922A，2015-09-02)。但上述工艺和菌株主要用于啤酒上，并未将其应用于葡萄酒，而且菌株通过筛选突变而来，重复性差。

另外，目前在葡萄酒发酵过程中主要通过工艺条件优化控制葡萄酒中高级醇的含量。徐燕等人将酵母菌接种量控制在3％-5％，发酵罐装液量控制在70％-80％；葡萄酒发酵过程中，发酵醪液pH值控制在3.2-4.0，发酵温度控制在22℃-25℃，发酵醪液α-氨基氮含量控制在180mg/L-195mg/L，发酵醪液含氧量控制在8mg/L-10mg/L；发酵培养12d-15d后，向发酵醪液中添加SO₂，添加量为120mg/L-140mg/L，通过对影响葡萄发酵过程中高级醇生成量的几个因素的综合考量和配置，大幅度减少了葡萄酒中高级醇的含量，改善了红葡萄酒的口感(中国专利，CN108060039A，2018-05-22)，翟衡等人通过在培养酵母的平板中添加一定量的氯乙酸异戊酯，筛选的低产高级醇的酵母菌种可以使葡萄酒中高级醇的含量降低10％-15％左右(中国专利，CN103627646B，2015.05.13)。但是通过工艺控制，较难保持葡萄酒产品的风味稳定性；而通过压力筛选的突变菌株在压力去除的工业应用过程中很容易回复突变。故在葡萄酒酿造过程中，应用工业微生物育种构建调控双乙酰和高级醇的酵母菌株，是解决双乙酰和高级醇含量较高的问题根本方法，也是国内外提高酒类风味质量的重要研究方向。