[发明专利]一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法

说明书

本发明属于卵母细胞冷冻技术领域，具体涉及一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法。该卵母细胞冷冻保存液包括一份平衡液一、一份平衡液二和一份玻璃化液，本发明聚焦卵母细胞的细胞结构，针对常规冷冻体系进行优化，改良了冷冻组分配比，添加了特异性冷冻保护剂，创新性的设计出卵母细胞特异性冷冻试剂，经鼠胚及废弃人卵母细胞冷冻实验验证，效果较现有胚胎冷冻试剂有较大提升。

技术领域

本发明属于卵母细胞冷冻技术领域，具体涉及一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法。

背景技术

卵母细胞冷冻保存可为由年龄及医疗因素引起的卵巢功能衰退的妇女保存生育能力，有利于改善卵母细胞捐赠程序及缓解胚胎冻存引发的一系列问题。目前进行卵母细胞冷冻主要采用玻璃化冷冻技术，这种方式能够显著降低卵母细胞冷冻时冰晶形成所带来的细胞损伤，尽管如此，冷冻保存后卵母细胞的发育潜能仍明显低于新鲜卵母细胞。有研究表明，冷冻过程中温度和渗透压的剧烈改变以及冷冻保护剂的毒性等将导致细胞骨架的损伤，微管破坏和纺锤体损伤，使染色体异常率增高，胚胎非整倍体发生率上升，胚胎的发育潜力下降。因此，进一步优化冷冻体系，减轻冷冻对卵母细胞的损伤，使冷冻复苏后的卵母细胞仍保持较高的发育潜能，是当前生殖医学研究热点问题，也是亟待解决的问题。

目前为止，市面上并没有专门的卵母细胞冷冻解冻试剂，进行卵母细胞冷冻主要采用商品化的胚胎玻璃化冷冻试剂，如进口试剂(日本KITAZATO，瑞典Vitrolife，美国SAGE等)，国产试剂(瑞柏，捷鹰等)。现有商品化的玻璃化冷冻液主要采用由平衡液(equilibrium solution,ES)、玻璃化液(vitrificationolution,VS)和基础液(basalsolution,BS)组成，主要以渗透性保护剂和非渗透性保护剂合理配比为主。

由于卵母细胞与胚胎结构不一致，对于冷冻的耐受程度不一样，与胚胎相比，卵母细胞表面积与体积的比例较小，在冷冻的过程中容易脱水不充分，形成细胞内结晶，冷冻过程引起渗透性休克；此外，由于冷冻保护剂的种类较多，各自的细胞毒性和保护潜能也不相同。现有的胚胎冷冻体系应用于卵母细胞冷冻仍然存在一定的弊端，不具有卵母细胞冷冻的特异性，采用胚胎冷冻试剂行卵母细胞冷冻后，其复苏存活率、后续受精及胚胎发育均不理想。

发明内容

针对现有技术缺乏针对卵母细胞特性的冷冻体系的问题，本发明提供一种卵母细胞冷冻保存液及保存方法，以解决上述技术问题。本发明聚焦卵母细胞的细胞结构，针对常规冷冻体系进行优化，改良了冷冻组分配比，添加了特异性冷冻保护剂，创新性的设计出卵母细胞特异性冷冻试剂，经鼠胚及废弃人卵母细胞冷冻实验验证，效果较现有胚胎冷冻试剂有较大提升。

本发明的技术方案为：

一种卵母细胞冷冻保存液，包括一份平衡液一、一份平衡液二和一份玻璃化液，

所述平衡液一包括基础液、2-3％乙二醇、1-1.5％二甲基亚砜、1.5-2.0％丙二醇，上述百分数均为体积百分比；

所述平衡液二包括基础液、7-8％乙二醇、3.5-4.0％二甲基亚砜、3.5-4.0％丙二醇、5-30μM(μmol/L)染料木黄酮，上述百分数均为体积百分比；

所述玻璃化液包括基础液、14-16％乙二醇、7-8％二甲基亚砜、7-8％丙二醇、0.4-0.6M(mol/L)蔗糖、5-25μΜ(μmol/L)染料木黄酮，上述百分数均为体积百分比。

作为优选，所述卵母细胞冷冻保存液，包括以下重量份的组分：平衡液一1份、平衡液二1份和玻璃化液1份，由于对于卵母细胞的处理为一个连续的过程，为了便于使用，三个组分各自独立包装，并放置在一个包装盒内。

作为优选，所述的卵母细胞冷冻保存液还包括基础液1份。

作为优选，所述基础液为含有质量分数21-22％SPS(血清蛋白替代品)的基础试剂；进一步优选，所述基础液为含有质量分数20％SPS(血清蛋白替代品)的基础试剂。