[发明专利]干扰猪CRTC3表达的质粒及腺病毒的构建方法及其用途

权利要求书

1.一种干扰猪CRTC3基因表达的质粒的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1)、根据猪CRTC3基因序列和载体的信息设计得到3个靶序列，根据靶序列设计并合成三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物；

2)、pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：将三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物的退火产物与BamH I和Hind III酶切的pAdM-FH-GFP载体连接转化，得到pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒。

2.根据权利要求1所述的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法，其特征是还包括如下的步骤3)：将pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒转染猪IPEC-J2细胞，筛选得到干扰效率最佳的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3。

3.根据权利要求1或2所述的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法，其特征是：所述步骤1)为：所述3对shRNA引物为：

shRNA1：

sh1-F：5-GATCCGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTTCAAGAGACAATCTTCTCGCTGAACTTCCTTTTTTA-3，

sh1-R：5-AGCTTAAAAAAGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTCTCTTGAACAATCTTCTCGCTGAACTTCCG-3；

shRNA2：

sh2-F：5-GATCCGGCTAACATCTGCACTCAACATTCAAGAGATGTTGAGTGCAGATGTTAGCCTTTTTTA-3，

sh2-R：5-AGCTTAAAAAAGGCTAACATCTGCACTCAACATCTCTTGAATGTTGAGTGCAGATGTTAGCCG-3；

shRNA3：

sh3-F：5-GATCCGCTCAATAAGACAGCGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCGCTGTCTTATTGAGCTTTTTTA-3，

sh3-R：5-AGCTTAAAAAAGCTCAATAAGACAGCGCTTTCTCTCTTGAAGAAAGCGCTGTCTTATTGAGCG-3。

4.根据权利要求3所述的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法，其特征是：所述步骤2)中，将构建所得的pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒进行测序和PCR鉴定；

PCR引物为：

CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG。

5.根据权利要求3所述的pAdM-FH-GFP-sh-CRTC3的构建方法，其特征是：将pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3表达质粒转染到IPEC-J2细胞，48h后收集细胞样品进行western blot和定量PCR验证效果，从而筛选获得最佳的重组质粒；定量PCR引物为：

qCRTC3-F：GACAAGCCAGGACGACAGTT

qCRTC3-R：GGTGCTTCTCTTCCTTCCAA。

6.利用pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3构建腺病毒的方法，其特征是：将重组质粒pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3，转染至HEK293T细胞制备腺病毒。

7.猪CRTC3的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3质粒及腺病毒的用途，其特征是：用于敲除猪肌内脂肪和皮下脂肪细胞中CRTC3基因的表达，用于研究猪糖脂代谢及相关基因表达等产生的影响。