[发明专利]干扰猪CRTC3表达的质粒及腺病毒的构建方法及其用途

说明书

本发明公开了一种干扰猪CRTC3基因表达的质粒的构建方法，包括以下步骤：根据猪CRTC3基因序列和载体的信息设计得到3个靶序列，根据靶序列设计并合成三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物；将三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物的退火产物与BamH I和Hind III酶切的pAdM‑FH‑GFP载体连接转化，得到pAdM‑FH‑GFP‑sh(1～3)‑CRTC3重组质粒。本发明还同时提供了猪CRTC3的pAdM‑FH‑GFP‑sh1‑CRTC3质粒及腺病毒的用途：用于敲除猪肌内脂肪和皮下脂肪细胞中CRTC3基因的表达，用于研究猪糖脂代谢及相关基因表达等产生的影响。

技术领域

本发明涉及一种干扰猪CRTC3(cAMP responsive element binding regulatedtranscription coactivators)表达的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3质粒及其腺病毒的构建方法和用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

猪的脂肪组织在体内不同部位的沉积直接影响着猪的胴体性状和猪肉品质，如肌内脂肪沉积的多少影响了猪肉的肉色、风味和嫩度；皮下脂肪沉积则影响猪肉的胴体品质。猪的脂肪沉积过程主要包括脂肪前体细胞的增殖、分化和聚酯，受到脂肪沉积相关基因的调控。CRTC3是一个在脂肪组织中高度表达的基因，在小鼠上研究发现，全身敲除CRTC3促进棕色脂肪组织发育，提高能量消耗，促进了白色脂肪组织的脂解作用；在高脂饮食条件下，全身敲除CRTC3显著抑制高脂诱导的肥胖。这些结果揭示，CRTC3调控脂肪沉积。

但目前CRTC3在调控猪脂肪沉积方面的研究还未见报道，其是否对皮下脂肪和肌内脂肪存在差异性调控机制仍未知。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供高效干扰CRTC3基因表达的靶序列、pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3质粒及其腺病毒的构建方法以及用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种干扰猪CRTC3基因表达的质粒(pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3)的构建方法，包括以下步骤：

1)、根据猪CRTC3基因序列和载体的信息设计得到3个靶序列，根据靶序列设计并合成三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物(shRNA1、shRNA2、shRNA3)；

2)、pCRTC3-sgRNA表达载体的构建：将三对猪CRTC3的shRNA(1～3)引物的退火产物与BamH I和Hind III酶切的pAdM-FH-GFP载体连接转化，得到pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒。

即，为将pAdM-FH-GFP载体进行BamH I和Hind III双酶切，与shRNA(1-3)引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌；从而得到猪CRTC3的pAdM-FH-GFP-sh(1-3)-CRTC3的重组质粒。

作为本发明的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法的改进，还包括如下的步骤3)：将pAdM-FH-GFP-sh(1～3)-CRTC3重组质粒(表达质粒)转染猪IPEC-J2细胞，筛选得到干扰效率最佳的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3。

作为本发明的pAdM-FH-GFP-sh1-CRTC3的构建方法的进一步改进，步骤1)为：所述3对shRNA引物为：

shRNA1：

sh1-F：5-GATCCGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTTCAAGAGACAATCTTCTCGCTGAACTTCCTTTTTTA-3，

sh1-R：5-AGCTTAAAAAAGGAAGTTCAGCGAGAAGATTGTCTCTTGAACAATCTTCTCGCTGAACTTCCG-3；

shRNA2：