[发明专利]重组果胶酶及其基因、重组载体、制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种重组果胶酶及其基因、重组载体、制备方法和应用，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；或3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建重组载体并转化酵母，可实现该重组果胶酶在高密度发酵条件下的组成型分泌表达，通过单纯的镍亲和纯化，即可得到纯度高于95％和蛋白浓度较高的活性蛋白，该活性蛋白在低温下具有很强的水解果胶活性，将为提高果汁的出汁率提供一种新型且高效的酶产品。

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，涉及一种重组果胶酶及其基因、重组载体、制备方法和应用。

背景技术

我国幅源辽阔，国土面积约为960万平方公里的土地，横跨南北寒带、温带、亚热带三大区域，适宜多种果树生长，因此我国是世界上水果生产的大国，如：山楂、苹果、梨、桃、杏、葡萄、酸枣、沙棘、黑加仑、猕猴桃、柑、橙、桔、菠萝、香蕉、番不榴、刺梨、西番莲等等。近十年来，我国水果总产量保持在四千五百万吨以上。水果资源丰富，为我国果汁工业的发展，提供了良好的基础。目前，果汁市场竞争激烈，品牌众多，许多加工企业都陷入困境，如何发展果汁工业，已成为一个值得重视的课题。而如何提高果汁的出汁率是果汁生产面临的第一大问题。因此，工业生产中，往往添加一定量的果胶酶来提高了汁率。果胶酶能够的作用是分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易。然面，工业用的果胶酶是多种酶的混合物，其添加在提高果汁出汁率的同时也会带来一些不良的影响，如风味和品质易发生变化等等。因此，开发具有高活性的单一成分果胶酶纯品迫在眉睫。

本发明的发明人的前期研究中发现了一种高活力的源自于茯苓的高活性新型果胶酶，但该酶在茯苓中的表达量很低，无法通过茯苓发酵的方法大量获得该酶。因此，利用外源基因表达系统高效表达该新型重组果胶酶蛋白是其开发应用的必由之路。

利用外源基因表达系统来生产重组果胶酶是大量获得果胶酶的主要技术手段之一。目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等。大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达系统。不少研究者将外源基因构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒副作用，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活，因此该表达系统并不适合于大量生产重组果胶酶。昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等外源基因表达系统对技术、设备和技术水平的要求太高，因此生产的产品往往价格都很高，同样不适合果胶酶的大量且低成本地生产。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia pastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具最显著的优点：通过筛选高水平分泌表达的转化子和优化表达条件，可以廉价且大规模地生产和制备重组蛋白。

本发明经反复优化基因和改变表达载体与菌株，获得了一种可以在毕赤酵母中实现组成型高水平分泌表达的转化子，该转化子在发酵罐高密度培养条件下，实现了该新型重组果胶酶蛋白的高水平表达和纯化，该纯化的重组果胶酶蛋白能提高水果的出汁率，具有重要的应用开发价值。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种提高果汁出汁率的新型重组果胶酶的制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：