[发明专利]一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法

权利要求书

1.一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70~75 %酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-70~-80 ℃保存24 h；

（2）纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5 mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5~1 mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；

（3）将步骤（2）中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10~20 min，100~200 g离心2~5 min，将上清液转移至一个新的1.5 mL的无菌Ep管中；

（4-1）将步骤（3）中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600 mV，工作2~4 s，间隔3~8 s，共重复40~50次；

（4-2）将步骤（4-1）中无菌Ep管冰上冷却5~10 min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600 mV，工作2~4 s，间隔3~8 s，共重复40~50次，收集破碎产物；

（4-3）将步骤（4-2）收集的破碎产物，在4~8 ℃条件下2000~4000 g离心5~8 min，收集上清液，并得到沉淀；

（5）在步骤（4-3）得到的沉淀中加入0.5~1 mL的STE缓冲液和50~80 μL的浓度为20~50mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1 ℃水浴20~30 min，得到混悬液；

（6）将步骤（5）得到的混悬液2000~4000 g离心5~8 min，收集上清液，并与步骤（4-3）收集的上清液混合；

（7-1）在步骤（6）混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；

（7-2）在步骤（7-1）收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；

（8-1）在步骤（7-2）收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；

（8-2）在步骤（8-1）收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；

（9）在步骤（8-2）收集的上清液中加入0.6~1.0倍体积的预冷的80%异丙醇，-18~-20 ℃冰冻10~20 min后，10000~12000 g离心5~10 min，再用100%异丙醇洗两次沉淀；

（10）在步骤（9）中经100%异丙醇洗后的沉淀中加入50~100 μL的TE缓冲液，室温放置2~5 min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-70~-80 ℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，以1 L的STE缓冲液体积计，步骤（2）和步骤（5）中所用STE缓冲液由50~100 mmol/L的Tris-HCl、50~100 mmol/L的EDTA•2Na、0.5~1 %的CTAB和0.8~1 mol/L的NaCl组成，用NaOH调节STE缓冲液的pH值至7.5~8.5。

3.根据权利要求1所述的一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，以1 L的TE缓冲液体积计，步骤（10）中所用TE缓冲液由5~10 mmol/L的Tris-HCl和5~10mmol/L的EDTA•2Na组成，用NaOH调节TE缓冲液的pH值至7.5~8.5。