[发明专利]一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法

说明书

本发明公开的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，通过超低温冷冻肠道样品，以便于肠道内容物的收集和肠道粘膜的剥离，利于样品中的细菌收集；在细菌收集步骤中，通过低速离心除去样品中的组织碎片；超声波破碎收集的细菌，加入STE缓冲液除去细菌中的蛋白质和多聚糖，并加入酚氯仿溶液和氯仿异戊醇溶液进一步去除可溶性杂蛋白；最终通过异丙醇抽提获取鱼类肠道细菌群落基因组DNA。本发明提取方法采用常规实验试剂和设备，无特殊实验条件要求，可以在较短时间内获取鱼类肠道细菌群落基因组PCR扩增所需的DNA模板，操作步骤简便，重复性好，易于操作推广。该提取方法的成本低于商业化试剂盒，具有广泛的应用价值和前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法。

背景技术

细菌群落基因组DNA的提取方法主要有细胞裂解后苯酚-氯仿抽提、异丙醇纯化以及SDS沉淀法，也有采用chelex-100或碱性裂解提取法等。目前提取肠道细菌群落基因组相对较为简便的方法是采用商业化粪便或者土壤细菌群落基因组DNA提取试剂盒。通过试剂盒提取获得的基因组DNA，通常去除原有细菌群落样本中的蛋白质和脂肪酸，再通过醇类沉淀去除加入的酚类等试剂，所得DNA质量较高，可满足多数实验需求。

肠道细菌群落基因组DNA是DGGE分析和建立有代表性的16S rRNA文库的基础，这些技术和方法广泛应用于多项研究和应用领域，例如对鱼类肠道细菌群落结构的多样性分析、细菌群落结构特征鉴定等。但现在没有针对鱼类肠道细菌群落基因组DNA提取的商业化试剂盒，而目前实验室培养方法只能分离纯化自然界约1％的微生物。采用分子生物学方法研究肠道环境中细菌群落，需要先克服肠道环境中细菌种类众多、成分复杂、干扰性物质影响下游实验操作等问题，因此，建立一种针对肠道环境的高效、快速的细菌群落基因组DNA提取方法是进行肠道样品细菌群落研究的基础。

鱼类肠道细菌群落基因组DNA提取的目标是获取高质量的基因组DNA，保证DNA的完整性，便于进一步建立DGGE分析方法和代表性的16S rRNA文库。但是鱼类肠道环境成分十分复杂，尤其在基因组DNA提取过程中难以去除脂类、酸性物质等有机物，直接影响下游的PCR扩增、酶切反应的效果。除此之外，个体较小鱼类肠道样品含有的细菌群落数量也较少，经过细胞破裂、蛋白质等去除、DNA纯化等多个步骤，最终获取的基因组DNA浓度或者纯度较低，不足以进行下游的实验操作，目前大多基因组DNA提取方法都存在这些问题。

为了解决提取鱼类肠道细菌群落基因组DNA存在的细菌裂解不完全、酶反应抑制物、DNA不完整等问题，需要一种适合鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中细菌裂解不完全、酶反应抑制物、DNA不完整等缺陷，提供一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，该提取方法操作步骤简便，重复性好，可获得纯度和浓度较高、完整的DNA，成本低于商业化试剂盒，具有广泛的应用价值和前景。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70～75％酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-70～-80℃保存24h；

(2)纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5～1mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；

(3)将步骤(2)中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10～20min，100～200g离心2～5min，将上清液转移至一个新的1.5mL的无菌Ep管中；