[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法和应用

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法及应用，设计了特异性靶向甘蓝型油菜Bna.TT8基因的sgRNA并制成Oligo二聚体，与Cas9载体连接，通过农杆菌介导的遗传转化技术导入到甘蓝型油菜下胚轴愈伤并再生成苗，Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，剪切目标序列，每条sgRNA都能通过CRISPRcas9系统介导A和C基因组上Bna.TT8基因的剪切，达到基因敲除的目的。经过表型鉴定，发现纯合突变株系的抗旱性显著增强，同时含油量也明显提高，为油菜性状改良提供了新方法。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及两种特异性靶向甘蓝型油菜Bna.TT8基因的sgRNA以及利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法，可用于培育抗旱、高油的油菜品种。

背景技术

油菜是我国重要的油料作物，现在全国种植面积达1亿亩，长江流域是我国油菜的主产区。在三大栽培种中，甘蓝型油菜(Brassica napusL.)是产量最高，种植最广泛的油菜品种。目前我国油菜产业发展战略是以消费者需求和产业发展需求为导向，以高产、高油、多抗、双低油菜的全部产业链开发为主线，以理论、技术和产品创新促进油菜的多元发展。因此，提高抗逆性和含油量是油菜育种的重要目标。传统的杂交育种是提高我国油菜产量和品质的重要育种途径，但是杂交育种也存在着很多制约因素，比如制种效率不高，劳动强度大，育种耗时长，遗传背景复杂以及易受环境影响等问题。而利用新的基因工程技术如CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术则可以创建无转基因成分的可用于油菜性状改良的新的油菜种质资源，为解决这些问题提供更多的选择。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌应对外源病毒入侵的防御系统，现在已广泛用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、植物如油菜、水稻、拟南芥等的基因改造。它由sgRNA和Cas9核酸酶两种元件组成，特殊设计的引导序列sgRNA可以通过碱基互补配对来识别基因组中相对应的序列，从而来引导Cas9核酸酶对其DNA双链进行切割，造成双链断裂(DSB)，当DNA双链通过同源重组(HR)或非同源重组(NHEJ)进行DNA修复，在修复的过程中会导致DNA序列的定点突变。虽然通过CRISPR/Cas9技术可以对基因进行编辑以改良农作物，但如在油菜这种异源多倍体作物中，基因在A基因组和C基因组中都有拷贝。只有这些同源拷贝一起突变，才能获得基因敲除突变体。在同源保守区域设计sgRNA并且在同一区域设计两个sgRNA，不仅可以提高编辑效率，还可以降低脱靶效应。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种利用CRISPR/Cas9系统敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法及其应用，通过设计Oligo DNA序列和CRISPR/Cas9载体，能够快速构建Bna.TT8基因敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化，筛选获得的Bna.TT8基因敲除的突变株可用于油菜性状改良。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

利用CRISPR/Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜Bna.TT8基因的方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据Bna.TT8基因两个拷贝的保守区域设计了两个sgRNA的DNA序列，两个sgRNA分别位于Bna.TT8基因外显子以及其中的bHLH保守结构域，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；

(2)根据sgRNA序列和CRISPR/Cas9载体要求，设计合成两对单链Oligo DNA序列，其序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；

(3)将两对单链Oligo DNA退火形成双链，制成Oligo二聚体；

(4)将制备好的Oligo二聚体与CRISPR/Cas9载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α，获得植物表达载体；