[发明专利]检测Ⅰ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法

权利要求书

1.一种Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测引物组，其特征在于，所述引物组包括四条引物或与其同源性为90％的核苷酸序列；所述四条引物具体为：

特异性上游引物S5：5’-GCCTACCTATGGCTAACGCC-3’；

特异性下游引物A5：5’-CACACTCAATGGAGCGAATCC-3’；

通用性上游引物S2-2：5’-AATCCTCCGGCCCCTGAATG-3’；

通用性下游引物A2Y：

5’-GTCACCATAAGCAGCCACAATAAAATAAAAG-3’；

延伸引物PY1-P4：5’-GTTTGTGACCACCTGC-3’；

延伸引物PY1-P1：5’-TCGTAACGCGCAAG-3’。

2.一种Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：从检测样品中获得脊髓灰质炎病毒，并提取RNA；

步骤2：采用权利要求1所述的特异性上游引物S5、特异性下游引物A5、通用性上游引物S2-2及通用性下游引物A2Y，利用模板RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行RT-PCR扩增，得到含有Ⅰ型脊灰减毒非编码区480位点和525位点的片段；其中，RT-PCR扩增采取一步法或两步法完成；

步骤3：对步骤2所得的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；

步骤4：利用权利要求1所述的延伸引物PY1-P4和延伸引物PY1-P1对步骤3所得脱磷酸片段进行单碱基延伸反应；

步骤5：对步骤4延伸后的样品进行脱盐纯化处理；

步骤6：脱盐处理后用核酸质谱仪检测分析目标基因特定位点的基因序列。

3.如权利要求2所述的Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测方法，其特征在于，一步法RT-PCR采用25μL扩增反应体系，其包括以下组分：2×Buffer12.5μL、酶1.0μL、上游引物(S5或S2-2)3.0μL，下游引物(A5或A2Y)3.0μL，模板RNA 1.0μL，DEPC水4.5μL；

一步法扩增反应条件：50℃30min；95℃5min；95℃30s，56-70℃10s，72℃10-20s，25-40个循环；72℃1min；4℃恒温。

4.如权利要求2所述的Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测方法，其特征在于，两步法RT-PCR中逆转录采用50μL反应体系，其包括以下组分：dNTP 1.0μL、DEPC水28.0μL、下游引物(A2-2或A5)1.0μL、5×Buffer 10.0μL、DTT2.0μL、RNA抑制剂1.0μL，MLV 2.0μL；

逆转录反应条件：37℃50min；95℃5min；

PCR扩增反应体系包括以下组分：DNA聚合酶2×Buffer 12.5μL、上游引物(S5或S2-2)3.0μL，下游引物(A5或A2Y)3.0μL，cDNA 5.0μL、DEPC水1.5μL；

PCR扩增反应条件：95℃30s，56-70℃10s，72℃10-20s，25-40个循环；72℃1min；4℃恒温。

5.如权利要求2所述的Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤3中的去磷酸化用的2μL反应体系包括如下组分：高压灭菌纯化水1.53μL、磷酸消化酶缓冲液0.17μL、磷酸消化酶0.30μL；去磷酸化反应条件：37℃40min，85℃5min；12℃恒温。

6.如权利要求2所述的Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测方法，其特征在于，步骤4中单碱基延伸用的2μL反应体系包括如下组分：高压灭菌纯化水0.169μL、延伸缓冲液0.200μL、延伸引物混合液0.940μL、测序酶0.041μL；反应条件：95℃30s；[95℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个循环]40个循环；72℃3min；12℃恒温。