[发明专利]检测Ⅰ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法

说明书

本发明公开了一种Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测引物组，包括如下引物对：特异性上游引物S5、特异性下游引物A5、通用性上游引物S2‑2、通用性下游引物A2Y、延伸引物PY1‑P4、延伸引物PY1‑P1。还公开了Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区480位点和525位点核酸质谱检测方法，其将RT‑PCR和质谱检测技术相结合，实现准确定量检测Ⅰ型脊灰减毒活疫苗特定位点的突变率，并具有非放射性、非动物体内等优点，为判断Ⅰ型脊灰疫苗株毒力情况提供重要的数据支持。此外，还公开了上述引物组及质谱检测方法的应用，以便于采用更方便、检测突变率精确度高的方法检测Ⅰ型脊灰疫苗株的突变情况。

技术领域

本发明属于单核苷酸多态性检测技术领域，具体涉及一种检测Ⅰ型脊灰减毒活疫苗核酸突变的质谱检测引物组及其方法。

背景技术

Ⅰ型脊髓灰质炎减毒活疫苗株—SabinⅠ株是将脊髓灰质炎病毒 Mahoney株通过不断传代和筛选纯化，选育出的免疫原性好，神经毒力低的病毒株。因为SabinⅠ株是活病毒，所以口服后会引起隐性感染，刺激人体在粘膜免疫和体液免疫的过程中产生保护性抗体。这些保护性抗体会在人体遇到野生病毒攻击时，对人体提供保护。此外，脊灰减毒疫苗株在人体内经过繁殖后会以活病毒形式通过肠道排出体外。不致病的减毒活疫苗病毒在环境中存活，可以刺激周围人群产生保护性抗体，从而形成保护屏障，阻断脊灰病毒在自然界的传播。减毒疫苗株是活病毒，在繁殖的过程中有可能产生突变，其中有很少部分会有恢复野毒毒性的倾向，其非编码区480位点和525位点核酸发生回复突变，可能导致毒力升高，并使接种疫苗的儿童发生疫苗相关麻痹性脊灰(VAPP)。因此，在脊髓灰质炎减毒活疫苗生产和使用的过程中，通过监控脊灰病毒毒力突变情况，对脊灰减毒疫苗株及其衍生物的基因稳定性进行检测，是疫苗安全性评价的重要指标。

疫苗毒力检测的经典方法为猴体神经毒力试验，后来又建立了转基因小鼠模型。这两种方法可以通过动物体征的改变对脊灰病毒的神经毒性进行直接观察和评估。但这两种方法分别存在需要使用特殊的动物，费用高昂、耗时很长，试验步骤繁琐、结果判断存在一定主观性等问题。随着分子生物学技术的发展，发现了Ⅰ型脊髓灰质炎病毒的减毒性状相关的一些突变位点。对于这些位点的碱基突变进行检测，可以对疫苗的毒力等遗传稳定性进行评估。而现有技术中将聚合酶链反应和限制性酶切相结合，产生了MAPREC技术，即通过PCR引入非突变病毒上没有的限制性内切酶酶切位点，通过酶切后电泳分离的方法，鉴别突变病毒和未突变病毒。但是MAPREC试验需要放射性核素标记，对实验设施设备的要求较高，过程复杂。此外，用于基因突变的研究方法还有定量荧光PCR和基因测序等方法，但是都存在局限性，例如：定量荧光PCR是在PCR反应体系中加入荧光标记的特异性引物和探针，通过对探针荧光信号变化情况的实时监测，来分析样品中的基因突变情况，该方法对突变的检测通常只能是相对定量，在同一孔中同时检测多个突变位点时，需要使用不同的荧光通道；又如测序法包括Walter Gilbert化学法和Sanger双脱氧链终止法。现在主要使用的是Sanger测序法，该方法步骤繁琐，试验周期长(一般需2-3天)，对操作人员技术水平要求高，更为重要的是，测序技术本身灵敏度不高，通常只能检测15％以上的突变。而SabinⅠ疫苗株非编码区480位点和 525位点核酸突变往往是一种混合物，即在同一位点既有减毒核苷酸碱基，也出现少量返祖基因碱基。这时测序方法对于固定靶点出现的低频率突变分辨十分困难，存在较大的不确定性，往往需要非常大的样本量和反复检测来进行分析。

基于现有技术中检测基因突变方法存在各种缺陷，本申请采用质谱检测法，建立脊灰减毒疫苗毒力相关位点突变的检测方法，具有准确、非放射性、非动物体内、直接定量的优点，一方面可以减少猴体等动物的使用，另一方面可以减少放射性物质的使用；此外由于可以对突变率进行准确定量，比测序方法更能全面了解突变情况。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种Ⅰ型脊灰减毒活疫苗非编码区 480位点和525位点核酸质谱检测引物组。