[发明专利]一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。本发明针对副肠孤病毒3型特异性的保守基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，同时采用人内源性Rnase P基因作为内参基因，采用Rnase P特异性引物和探针检测标本中内参基因RNA，利用实时荧光定量PCR技术能够更快速、准确且灵敏地检测出副肠孤病毒3型，特异性强、灵敏度高，在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析，定量线性范围好；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。

背景技术

人副肠孤病毒(human parechovirus，HPeV)是一种单股正链、无包膜的RNA病毒，属于小RNA病毒科，副肠孤病毒属。迄今为止，人类已经发现了16中不同型别的HpeV(HpeV1～16)。HpeV可在普通人群州农工流行，感染对象主要是儿童。其主要是通过粪口途径和飞沫途径传播，另外还有报道通过亲密接触感染该病毒的病例。多数患者仅出现轻微胃肠道及呼吸道等非特异性症状。3型人副肠孤病毒(human parechovirus 3，HPeV3)是2004年被发现的与儿童脓毒症密切相关的一种病原体，该病毒感染可引起急性缓驰性麻痹、无菌性脑膜炎、脑炎和心肌炎。

但是，目前针对HPeV3的现有检测方法如病毒分离、电镜观察、血清中和、ELISA及免疫荧光等，均存在操作繁琐、周期长，特异性差等弊端，急切需要开发一种新的能够快速且准确对病毒进行鉴定的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括副肠孤病毒3型特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因Rnase P特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.4-6。

一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。

进一步地，还包括：

阳性对照品：副肠孤病毒3型标准品；

内标溶液：含Rnase P序列的病毒样颗粒溶液；

阴性对照品：RNase Free H₂O。

一种副肠孤病毒3型实时荧光定量PCR检测方法，包括：以样品RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对和探针。

进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的副肠孤病毒3型的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：40℃15min；95℃5min；94℃15sec、60℃30sec，45个循环。

进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：

当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为副肠孤病毒3型阳性；

当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40就判断样品为副肠孤病毒3型阳性，否则判断样品为副肠孤病毒3型阴性；

当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为副肠孤病毒3型阴性；