[发明专利]一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法在审

专利信息
申请号: 201911206160.0 申请日: 2019-11-29
公开(公告)号: CN110804583A 公开(公告)日: 2020-02-18
发明(设计)人: 郑晓珂;张奇;袁培培;傅阳;侯颖;高丽媛;魏亚新;冯卫生 申请(专利权)人: 河南中医药大学
主分类号: C12N5/077 分类号: C12N5/077
代理公司: 郑州天阳专利事务所(普通合伙) 41113 代理人: 蔡文雅
地址: 450046 河南*** 国省代码: 河南;41
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摘要:
搜索关键词: 一种 油酸 诱导 胰岛素 抵抗 h9c2 细胞 模型 建立 方法
【权利要求书】:

1.一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)细胞培养

H9c2使用添加3.70g/L NaHCO3,3.6g/L Hepes,100U/mL青霉素和100g/mL链霉素为配方配制的DMEM,添加10%胎牛血清后,在37℃,5%CO2,饱和湿度的CO2培养箱中培养,待细胞长至70-80%处于对数生长期时进行实验;

2)葡萄糖消耗实验筛选油酸钠工作浓度

分别设立空白培养基对照孔、正常组和油酸钠浓度梯度组,H9c2细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中除空白培养基孔以外的实验孔,次日待细胞贴壁后给予空白孔和NC组完全培养基;分别给予油酸钠浓度梯度组含不同摩尔浓度油酸钠的完全培养基,每组平行6个复孔,在CO2培养箱中培养24h后检测各孔培养基上清液中葡萄糖含量,每孔加入20μL5g/L的MTT溶液,再次培养4h后,检测各个测量孔的OD值,各组葡萄糖消耗率=(空白孔葡萄糖含量-测量孔葡萄糖含量)/OD值×100%;

3)In-cell Western

设立NC和SO组,每个蛋白设立三个复孔,以5×104个/mL的密度接种H9c2于避光的96孔板中,给予NC组完全培养基,SO组含不同摩尔浓度油酸钠的完全培养基,药物干预24h后,弃去培养基,以3.7%甲醛固定细胞20min,0.1%Triton透化5次/5min,5%脱脂奶粉封闭1.5h,加入以封闭液稀释的待测抗原的特异性抗体,包括GLUT4、p-IRS-1、IRS-1、β-tubulin,在4℃孵育18h后,以含有0.02%Tween20的磷酸盐缓冲溶液洗涤除去未结合抗体,以相应荧光二抗避光孵育1h后,再次洗涤除去未结合二抗,在Odyssey双色红外荧光成像系统下扫描成像并量化数据。

2.根据权利要求1所述的用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法,其特征在于,所述的步骤2)中油酸钠最佳浓度为100-250μmol/L。

3.根据权利要求1所述的用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法,其特征在于,所述的步骤3)中油酸钠最佳浓度为150μmol/L。

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