[发明专利]一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法

说明书

本发明涉及用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法，可有效解决现有胰岛素抵抗细胞模型建模困难，在采用高浓度葡萄糖诱导胰岛素抵抗时，成模率较低，胰岛素作为一种激素类物质，具有很大的不稳定性，非常不容易保存的问题，其解决的技术方案是，1）细胞培养；2）葡萄糖消耗实验筛选油酸钠工作浓度；3）In‑cell Western；本发明选用油酸钠对大鼠心肌细胞株进行诱导，并成功建立胰岛素抵抗模型，首次证实油酸钠可以诱导细胞胰岛素抵抗，并明确了其诱发机制，开辟了油酸钠的新用途，是采用油酸钠诱导细胞胰岛素抵抗模型建立方法上的创新。

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法。

背景技术

胰岛素抵抗是一种由于各种原因导致机体对生理水平的胰岛素敏感性降低的病理状态，可表现为空腹血糖升高，高胰岛素血症，血脂紊乱，高血压等，是Ⅱ型糖尿病的发病基础，也是代谢综合征的核心。由胰岛素抵抗引发的多种代谢性疾病，会增加患者发生心肌损伤的发病率和患病后的死亡率。寻找治疗胰岛素抵抗的活性化合物，并在细胞水平探明这些化合物的作用机制是当代研究人员的义不容辞的责任。

目前常用的胰岛素抵抗细胞模型的建立方法包括棕榈酸、葡萄糖、胰岛素诱导法，但各种方法均具有一定的缺陷。棕榈酸具有明显的细胞毒性，这种毒性在200μmol/L的浓度下就开始逐渐显现，而该浓度却是诱导细胞胰岛素抵抗的常用浓度，而且由于棕榈酸是一种脂肪酸，所以它水溶性较差，又加大了建立模型时操作上的困难；由于葡萄糖是细胞生存的必须营养物质，这就决定了一些对营养物质需求较高的细胞例如心肌细胞，骨骼肌细胞等可能具有较高的葡萄糖耐受性，在采用高浓度葡萄糖诱导胰岛素抵抗时，成模率较低；胰岛素作为一种激素类物质，具有很大的不稳定性，非常不容易保存，所以寻找新的胰岛素抵抗建模方法非常必要。

诱导胰岛素抵抗发生的因素十分复杂，尚未完全确定，但可以明确的是胰岛素抵抗均伴随游离脂肪酸水平的升高，而过量油酸，棕榈酸等的脂肪酸诱导又会造成胰岛素抵抗。目前，采用油酸钠诱导细胞胰岛素抵抗模型的方法未见报道。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用油酸钠诱导的胰岛素抵抗H9c2细胞模型建立方法，可有效解决现有胰岛素抵抗细胞模型建模困难，在采用高浓度葡萄糖诱导胰岛素抵抗时，成模率较低，胰岛素作为一种激素类物质，具有很大的不稳定性，非常不容易保存的问题。

本发明解决的技术方案是，具体包括以下步骤：

1)细胞培养

H9c2使用添加3.70g/L NaHCO₃，3.6g/L Hepes，100U/mL青霉素和100g/mL链霉素为配方配制的DMEM(培养基)，添加10％胎牛血清后，在37℃，5％CO₂(V/V)，饱和湿度的CO₂培养箱中培养，待细胞长至70-80％处于对数生长期时进行实验；

2)葡萄糖消耗实验筛选油酸钠工作浓度

分别设立空白培养基对照孔、正常(NC)组和油酸钠浓度梯度组，H9c2细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板中除空白培养基孔以外的实验孔，次日待细胞贴壁后给予空白孔和NC组完全培养基；分别给予油酸钠浓度梯度组含不同摩尔浓度油酸钠的完全培养基，每组平行6个复孔，在CO₂培养箱中培养24h后检测各孔培养基上清液中葡萄糖含量，每孔加入20μL5g/L的MTT溶液，再次培养4h后，检测各个测量孔的OD值，各组葡萄糖消耗率＝(空白孔葡萄糖含量-测量孔葡萄糖含量)/OD值×100％；

3)In-cell Western