[发明专利]构建靶序列的测序文库的方法

权利要求书

1.一种构建靶序列的测序文库的方法，其包括：

（a）将接头添加至核酸片段的5’端和3’端以获得添加有接头的核酸片段，其中，所述核酸片段是通过对核酸进行片段化而获得；

所述接头在5’-3’方向上依次包含公用序列，任选的单分子条码，和任选的间隔序列；

（b）

（i）所述添加有接头的核酸片段与所述核酸片段相比在所述核酸片段的5’端和3’端分别向外延伸长度各自独立地为20-31个核苷酸的核苷酸序列，所述添加有接头的核酸片段直接用于捕获而没有扩增；或者

（ii）使用第一扩增上游引物和第一扩增下游引物，扩增所述添加有接头的核酸片段，以获得第一扩增子，所述第一扩增子与所述核酸片段相比在所述核酸片段的5’端和3’端分别向外延伸长度各自独立地为20-31个核苷酸的核苷酸序列，所述第一扩增上游引物的部分或全部序列与所述公用序列或其互补序列的部分或全部序列足够互补以实现对所述添加有接头的核酸片段的扩增，所述第一扩增下游引物的部分或全部序列与所述公用序列或其互补序列的部分或全部序列足够互补以实现对所述添加有接头的核酸片段的扩增；

（c）从所述添加有接头的核酸片段或所述第一扩增子捕获靶核酸片段而不使用接头封闭剂；

（d）使用第二扩增上游引物和第二扩增下游引物，扩增捕获的靶核酸片段，以获得第二扩增子作为测序文库的成员，由此构建所述测序文库，

所述第二扩增上游引物在5’-3’方向上依次包含上游测序仪桥接锚定序列，任选的索引序列，和上游测序序列，

所述第二扩增下游引物在5’-3’方向上依次包含下游测序仪桥接锚定序列，任选的索引序列，和下游测序序列，

所述公用序列或其互补序列的序列和所述第一扩增上游引物的序列各自是所述上游测序序列的序列的部分或全部，

所述公用序列或其互补序列的序列和所述第一扩增下游引物的序列各自是所述下游测序序列的序列的部分或全部。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述添加有接头的核酸片段或所述第一扩增子与所述核酸片段相比在所述核酸片段的5’端和3’端分别向外延伸长度各自独立地为24个核苷酸的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述单分子条码的长度为2-12个核苷酸。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述公用序列的长度为13-31个核苷酸。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述接头是单链接头或双链接头，其中,所述双链接头是双链Y型接头。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一扩增上游引物的5’端和/或3’端与所述接头的5’端/或3’端平齐或不平齐；和/或

其中所述第一扩增下游引物的5’端和/或3’端与所述接头的5’端和/或3’端平齐或不平齐。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中：

（1）所述核酸片段来自于单一样本；或者

（2）所述核酸片段来自于多个样本，且所述接头包含所述单分子条码。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述接头不含索引序列和测序仪桥接锚定序列。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一扩增上游引物和所述第一扩增下游引物各自独立地不含索引序列和测序仪桥接锚定序列。