[发明专利]构建靶序列的测序文库的方法

说明书

本发明涉及高通量核酸测序，和更具体地，构建靶序列的测序文库的方法和相应的试剂盒。

技术领域

本发明涉及高通量核酸测序，和更具体地，构建靶序列的测序文库的方法和相应的试剂盒。

背景技术

通过高效富集靶序列来构建针对靶序列的测序文库，能够有效降低测序成本、提高测序深度。对于通常需要高深度测序的应用，如体细胞突变检测，靶序列富集性能(如捕获效率)是决定方法灵敏度和特异性的主要因素。

目前常用的靶序列测序方法主要为基于核酸探针的液相杂交捕获法。现有技术方法可以包括如下主要步骤：1)对片段化DNA进行末端修复，用接头(包含测序仪桥接锚定序列(如适用于Illumina平台的P5/P7序列)、索引(index)序列、独特分子识别码(UniqueMolecular Identifier，UMI)序列(或称分子条形码/二维码，Molecular Barcode，MBC)等)连接片段化DNA以引入UMI、索引序列和引物扩增区域，用对应于引物扩增区域的引物进行第一轮扩增，由此构建完整的全基因组文库；2)使用核酸探针对完整的全基因组文库进行杂交和捕获，然后用相同引物进行第二轮扩增，以富集待测靶序列，由此产生用于靶序列的高通量测序的测序文库。

或者，现有技术方法可以包括如下主要步骤：1)对片段化DNA进行末端修复，采用带有UMI的截短型接头连接片段化DNA以引入UMI，2)再用带有测序仪桥接锚定序列和索引序列的引物进行第一轮扩增以引入测序仪桥接锚定序列和索引序列，由此构建完整的全基因组文库；和3)使用核酸探针对完整的全基因组文库进行杂交和捕获，然后进行第二轮扩增，以富集待测靶序列，由此产生用于靶序列的高通量测序的测序文库。该过程例如如图1所示。

然而这样的方法存在以下缺陷：完整的全基因组测序文库的成员的两端的接头的总长度(例如，从图1所示P5/P7至UMI的长度)通常为约60-80个核苷酸，携带具有这样长的接头的文库成员在被捕获的过程中互相结合(或称“互搭”)而形成复合物，从而显著降低靶序列的比例，导致捕获效率降低。

为了解决常规靶序列测序方法中由于文库成员的接头互搭而导致捕获效率降低的问题，通常在捕获过程中的探针杂交阶段添加接头封闭剂，其是通过采用特殊设计和修饰的、可以与接头序列高效结合的DNA，来抑制接头互搭(例如如图2所示)。但是由于接头封闭剂需要特殊设计和修饰且需要较高浓度来实现封闭效果，因此产生了相当高的检测成本。

因此，本领域需要具有高捕获效率和低检测成本的新的文库构建方法来进行靶序列测序。

发明内容

本发明通过提供新的构建靶序列的测序文库的方法满足了上述需要。更具体地，本发明人发现，通过从核酸片段构建特定架构的中间文库，然后从中间文库捕获携带靶序列的中间文库成员，再用引物补全并扩增中间文库成员以构建可用于靶序列的高通量测序的测序文库，本发明的方法在未使用现有技术方法所需的接头封闭剂的情况下，成功地以与现有技术方法相比维持或改善的捕获效率构建了测序文库，从而消除了现有技术方法对接头封闭剂的需要，由此降低了检测成本。

在一个方面，本发明提供了一种构建靶序列的测序文库的方法，其包括：

(a)将接头添加至核酸片段的5’端和3’端以获得添加有接头的核酸片段；任选地，所述核酸片段是通过对核酸进行片段化而获得；

所述接头在5’-3’方向上依次包含公用序列、任选的单分子条码、和任选的间隔序列；

(b)

(i)所述添加有接头的核酸片段与所述核酸片段相比在所述核酸片段的5’端和3’端分别向外延伸长度各自独立地为16-40个核苷酸的核苷酸序列，所述添加有接头的核酸片段直接用于捕获而没有扩增；或者