[发明专利]一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法

权利要求书

1.一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)在干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃；

(2)将步骤(1)的土壤进行DNA提取，所得的液体为土壤真菌DNA混合液体，将提取到的土壤真菌DNA混合液体放到-20℃备用；

(3)步骤(2)提取的DNA采用引物Tg进行qPCR试验，将检测到的Ct值代入标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。

2.根据权利要求1所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，步骤(2)DNA提取使用的是凯杰公司的DNA Isolation Kit。

3.根据权利要求1所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)qPCR试验反应程序为：95℃预变性2min；然后95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共40次循环后终止反应。

4.根据权利要求1所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，步骤(3)标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396的求取方法：

(1)提取干巴菌的DNA；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，用引物Tg进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)步骤(2)中扩增产物经切胶回收、连接腺嘌呤、连接载体，然后进行菌液PCR实验，并提取质粒，将所提取的3份质粒，分别稀释到50ng/μL，然后再依次稀释十倍，共稀释7个浓度梯度，分别为：5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL、0.000005ng/μL，进行qPCR实验确定最适的浓度梯度为：0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL、0.0005ng/μL、0.00005ng/μL；再用最适的浓度进行qPCR实验，重复两遍，最终确定标准曲线方程式为：y＝-4.639x+11.396，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。

5.根据权利要求1或4所述干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，其特征在于，引物Tg的核苷酸序列为Tg1：5’-ACCTGTGCACCCTCTGTAGTTCC-3’，如SEQ ID NO：1所示；Tg2：5’-GTCCAAGCTCATCATGGCA-3’，如SEQ ID NO：2所示，该引物为干巴菌多拷贝基因ITS的特异性引物。