[发明专利]一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法

说明书

本发明公开一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，在干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在‑80℃；将土壤进行DNA提取，所得的液体为土壤真菌DNA混合液体，将提取到的土壤真菌DNA混合液放到‑20℃备用；采用引物Tg进行qPCR试验，将检测到的Ct值代入标准曲线方程式计算得到土壤中菌丝体含量；本发明可以实现快速检测土壤中干巴菌菌丝体含量的目的，方法简单，高效。

技术领域

本发明涉及菌丝体含量的测定方法，特别是涉及一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法。

背景技术

菌丝体含量的测定对于探究真菌生长机理及代谢活动起到非常重要的作用，菌丝体含量可以作为衡量真菌生长状况的参数。测定土壤真菌的菌丝体含量的方法一般为间接测定法，间接测量法即通过测定真菌菌丝体中某些特殊物质的含量(如几丁质等)来推算出菌丝体的含量。主要的方法有：几丁质法、麦角固醇法、蛋白质法和核酸法。不同的测定方法均存在一定的局限性，实际测定时需根据实际需求选择较为适合的测量方法。

核酸是非常稳定的一种菌丝体测定方法，几乎不受众多外界因素的影响，与生物量存在很好的线性关系。固态发酵所用底物有时不可避免地含有少量DNA，底物中含有的核酸在发酵过程中不会发生变化，实际测定中可从测得的结果中减去底物所含核酸，因此并不影响测定结果。在核酸含量测定的方法中，实时定量PCR(qPCR)技术可快速准确的测定核酸含量。

对于大型外生菌根真菌生长的土壤中含有复杂的微生物群落，其他真菌对目标菌丝体含量的测定产生一定的干扰。而通过生物量的测定有助于确定子实体形成前后变化，分析菌塘及其共生植物根际的生长状况和松茸子实体形成的时间，能更加有效的对野生菌资源以及共生植物进行管理，实现可持续采摘。

目前，越来越多的真菌基因组测序已完成，利用生物信息学手段可快速筛选多个物种间的单拷贝直系同源基因(single-copy orthologous genes)用于探讨物种演化关系。再结合实验验证筛选结果的可靠性，可以获得的单拷贝基因作为实时定量PCR测定菌丝体含量的候选分子标记。但是，单考贝基因的挑选，需要具有较强的生物信息背景知识的专业人员才可获得。而ITS(多拷贝)序列是真菌的DNA条形码，在NCBI库中很容易获得，涵盖物种也比较全面。因此应用多拷贝基因的qPCR方法，也可快速计算出菌丝体的含量，对于探究干巴菌生长机理及代谢活动起到非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干巴菌土壤菌丝体含量的测定方法，该方法所用的基因为干巴菌多拷贝基因ITS，由于多拷贝基因ITS的拷贝数众多且未知，故测定的结果是相对值，能对不同地点不同深度的干巴菌菌丝体含量的高低进行快速比较，与单拷贝基因获得准确结果相比，利用多拷贝基因进行测定与比较更加高效和快速。具体步骤如下：

(1)在干巴菌生长地，用5点法，取以子实体为中心半径5cm，深度14cm的土壤，每2cm为一个土壤深度，共7个不同深度的土壤样品装入准备好的无菌取样袋中，进行编号，将土样保存在-80℃；

(2)将步骤(1)的土壤进行DNA提取，所得的液体为土壤真菌DNA混合液体，将提取到的土壤真菌DNA混合液体放到-20℃备用；

(3)步骤(2)提取的DNA采用引物Tg进行qPCR试验，将检测到的Ct值代入标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396，其中y是qPCR试验检测到的Ct值，x是菌丝体含量。

步骤(2)DNA提取使用的是凯杰公司的DNA Isolation Kit。

步骤(3)qPCR试验反应程序为：95℃预变性2min；然后95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共40次循环后终止反应。

步骤(3)标准曲线方程式y＝-4.639x+11.396的求取方法：