[发明专利]可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白及制备方法

权利要求书

1. 一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白，其特征在于：蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 用特定引物P1和P2对长牡蛎TIMP628基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述PCR反应条件为：94 ℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94 ℃变性30秒，55 ℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟；

b. 将扩增片段纯化回收并与pMD19-T载体连接，转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用Nde I和BamH I酶切质粒，对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

c. 将所回收的目的片段与经Nde I和BamH I酶切的表达载体pET-30a连接并转入大肠杆菌Transetta (DE3)中培养；

d. 挑取单克隆，接种于200 mL的LB液体培养基中，220 rpm，在37 ℃下培养至OD ₆₀₀ =0.4~0.8，加入终浓度1 mmol L^-1的诱导剂IPTG后继续培养4小时，于4 ℃，5000 rpm，离心10分钟，收集菌体；

e. 将所得到的菌体纯化、复性，即得到可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白的制备方法，其特征在于所述e步骤依次如下：

（1）镍琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20 cm，柱床体积为10 mL；

（2）用缓冲液I平衡2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；所述缓冲液I组成如下：50 mmolL^-1 Tris-Hcl缓冲液，pH 7.4；50 mmol L^-1 NaCl；8 mol L^-1 尿素；

（3）将d步骤所收集的菌体用缓冲液I重悬，150 W超声破碎30分钟，12000 rmp，4 ℃离心30分钟，取上清液并将上清液用0.45 μm 滤膜过滤后过柱，流速为1 mL min^-1；

（4）用缓冲液I洗2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；

（5）用缓冲液Ⅱ再洗2~5个柱床体积，流速为2 mLmin^-1；所述缓冲液Ⅱ是在缓冲液I中加入50 mmol L^-1咪唑；

（6）用缓冲液Ⅲ洗脱目的蛋白，收集；所述缓冲液Ⅲ是在缓冲液I中加入400 mmol L^-1咪唑；

（7）将所收集的蛋白透析复性。

4.一种如权利要求1所述可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白，其特征是在制备抑制灿烂弧菌胞外产物毒性药物中的应用。