[发明专利]可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白及制备方法

说明书

本发明公开一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白，蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组蛋白具有抑制灿烂弧菌胞外产物酶活性的作用，在制备灿烂弧菌胞外产物毒性抑制药物等方面具有应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白及制备方法。

背景技术

长牡蛎(Crassostrea gigas，Cg)是国际上重要的海水养殖经济贝类之一。近年来由细菌和病毒引起的疾病造成了长牡蛎大规模死亡，带来了巨大经济损失。研究发现，灿烂弧菌是主要致病菌之一，其胞外产物（Extracellular products, ECP）及其中的金属蛋白酶对长牡蛎稚贝具有较强毒性，能显著抑制长牡蛎免疫细胞的粘附及吞噬活性。在哺乳动物中，组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）蛋白能抑制机体自身组织金属蛋白酶活性进而抑制细胞迁移，并在抑制肿瘤迁移过程中发挥关键作用。迄今为止，尚未关于长牡蛎TIMP可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白。

一种可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白，其特征在于：蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种上述可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 用特定引物P1和P2对长牡蛎TIMP628基因编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

所述PCR反应条件为：94 ℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94 ℃变性30秒，55 ℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10分钟；

b. 将扩增片段纯化回收并与pMD19-T载体连接，转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用NdeI和BamH I酶切质粒，对酶切质粒产生的目的片段纯化回收；

c. 将所回收的目的片段与经NdeI和BamH I酶切的表达载体pET-30a连接并转入大肠杆菌Transetta(DE3)中培养；

d. 挑取单克隆，接种于200 mL的LB液体培养基中，220 rpm，在37 ℃下培养至OD ₆₀₀ =0.4~0.8，加入终浓度1 mmol L^-1的诱导剂IPTG后继续培养4小时，于4 ℃，5000 rpm，离心10分钟，收集菌体；

e. 将所得到的菌体纯化、复性，即得到可抑制灿烂弧菌胞外产物毒性的CgTIMP重组蛋白。

所述e步骤依次如下：

（1）镍琼脂糖凝胶 FF装柱，1.6×20 cm，柱床体积为10 mL；

（2）用缓冲液I平衡2~5个床体积，流速为2 mL min^-1；所述缓冲液I组成如下：50 mmolL^-1 Tris-Hcl缓冲液，pH 7.4；50 mmol L^-1 NaCl；8 mol L^-1 尿素；