[发明专利]一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法

权利要求书

1.一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

步骤一、试验材料，以20份菜心为试验材料，分别进行编号1～20，以珍珠岩为基质进行穴盘育苗，当幼苗长至三叶一心时，选取生长一致的健壮幼苗移栽到田间，常规栽培管理直至抽薹开花，于晴天上午采摘处于单核靠边期的花蕾进行游离小孢子培养，取样时主花序上的花蕾优先，其次为第一、第二分枝上的花蕾；

步骤二、小孢子游离，在无菌台上，将挑选好的花蕾放入烧杯中，用70％的酒精进行表面灭菌30s后，再用0.1％HgCl₂灭菌10～12min，接着用无菌水冲洗3次，每次冲洗5min，置于无菌圆底试管中加入少量的B5提取液，用玻璃棒将花蕾轻轻研碎，使小孢子游离到提取液中。再通过50μm孔径尼龙网除去花蕾组织碎片，收集滤液于10mL离心管中，滤液经900r/min离心3min，弃上清，再用B5提取液重新悬浮小孢子后再离心，如此重复3次，最后将所得小孢子沉淀用NLN液体培养基悬浮，用血球计数板将小孢子密度调整为1×10⁵～2×10⁵个/mL，分装至75mm培养皿中，用Parafilm封口；

步骤三、分析关键因素对菜心游离小孢子胚诱导的影响；

步骤四、小孢子培养，将分装好的小孢子培养皿置于恒温培养箱中进行热激诱导，之后转入25℃恒温培养箱中继续暗培养，至胚状体出现，培养25天后统计小孢子出胚数。

2.根据权利要求1所述的提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：所述的20份菜心为试验材料为，1、汉珍一号菜心，来源湖北；2、尖叶70天，来源广东；3、尖叶菜心，来源辽宁；4、澳洲改良80天油青甜菜心，来源广东；5、油青尖叶甜菜心，来源广东；6、甜菜心，来源广东；7、油青甜菜心，来源广东；8、全能特级80天油青甜菜心王，来源辽宁；9、玉冠一号广府青菜心，来源广东；10、油青菜心，来源辽宁；11、广澳油菜心，来源湖南；12、航育49-1菜心，来源甘肃；13、雪莹白菜苔，来源湖北；14、广润杂交菜心，来源广东；15、广府青菜心，来源广东；16、航天香脆菜心，来源广东；17、珍美45天尖叶油青菜心，来源甘肃；18、初恋小青菜一代杂交菜心，来源甘肃；19、四-九月菜心，来源香港；20、油绿粗薹菜心，来源广东。

3.根据权利要求1所述的提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，其特征在于：所述的关键因素对菜心游离小孢子胚诱导的影响，包括以下步骤：

步骤一、不同基本培养基对菜心小孢子胚状体诱导的影响：以20种基因型的菜心为试材，将获得的游离小孢子培养于蔗糖浓度为13％和1/2大量元素减少一半的NLN培养基，蔗糖浓度为13％的培养基上，研究不同培养基诱导产生胚状体的能力，得到菜心小孢子培养最佳培养基类型；

步骤二、不同激素种类及浓度对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以不同出胚数的菜心品种为材料，在培养基中加不同浓度的细胞分裂素(6-BA)和生长素(NAA)，未添加激素的培养基为对照，观察不同激素种类及浓度对菜心胚状体诱导的影响，获得菜心小孢子培养最佳激素配比；

步骤三、添加不同浓度活性炭对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以不加活性炭的培养基为对照，将胚产量不同的基因型为对象，研究添加不同浓度的活性炭对胚状体诱导率的影响，获得菜心游离小孢子培养最佳活性炭浓度；

步骤四、不同热激时间对胚胎发生的影响：以出胚数存在差异的菜心为研究对象，设置32℃热激处理6h、12h、24h、48h四个处理，以无高温预处理的新鲜小孢子培养为对照，研究不同热激时间对菜心游离小孢子胚诱导的影响；

步骤五、常规培养与改良方法培养对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响：以常规培养为对照，综合试验步骤一至步骤四的试验结果，组合成改良培养方法。以20个菜心品种为试验材料，研究这两种培养方法对菜心游离小孢子胚状体诱导的影响，花蕾采集、小孢子游离、暗培养等其他条件均保持一致。