[发明专利]一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法

说明书

本发明提供一种提高菜心游离小孢子胚状体出胚数的培养方法，第一步选取处于单核靠边期的菜心花蕾，消毒后分离纯化出游离小孢子，将纯化后的小孢子悬浮于NLN液体培养基中，用血球计数板将小孢子密度调整为1×10⁵～2×10⁵个/mL，获得小孢子悬浮液。第二步将制备好的菜心小孢子加入大量元素减半且添加6‑BA(0.05mg/L)、NAA(0.10mg/L)、活性炭(100mg/L)的NLN‑13培养基中，然后将分装好的小孢子培养皿置于恒温培养箱中进行32℃热激处理24h，之后转入25℃恒温培养箱中继续暗培养，直至胚状体出现。采用该种培养方法对菜心小孢子的诱导出胚具有明显促进作用，可提高小孢子出胚数。本发明具有方法实用、步骤具体、重复性好等特点，可实现菜心游离小孢子培养在单倍体育种上的广泛应用。

技术领域

本发明涉及菜心出胚数增加技术，具体涉及一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法。

背景技术

菜心(Brassica chinesis var.)，又名菜薹，为十字花科芸薹属一、二年生草本植物，由大白菜亚种和白菜亚种长期选择和栽培驯化而来，原产我国南部，是我国华南地区的特产。菜心生长周期短，在蔬菜周年供应尤其是淡季蔬菜供应上占有重要地位。选育出优质、丰产的新品种是菜心育种的重要目标之一。

菜心为异花授粉植物，杂种优势明显，但纯合非常困难，利用一代杂种培育优良的自交系亲本一般需6-8代(年)，要对所选单株进行连续多代剥蕾自交纯化，相当费工费时，且长期自交会出现自交衰退现象。应用游离小孢子培养技术获得单倍体进而加倍成后代完全纯合的双单倍体植株(DH植株)，可在较短时间内使材料得以纯化，从而大幅度缩短育种年限，而游离小孢子培养体系的开发是关键所在。小孢子培养是直接从花蕾或花药中获得游离小孢子进行培养，通过诱导胚状体，再生出完整的单倍体植株，最后经过自发或诱发染色体加倍，成为正常可育、纯合的二倍体植株的过程。尽管目前小孢子培养技术已经取得了较大进展，但在实际应用中，由于该技术涉及到的影响较多，每个因素的变化都可能使得小孢子培养出现重复性差，出胚数低等问题，许多因素的最佳条件有待于进一步研究。虽然已有研究者建立了大白菜、芥菜、辣椒等作物的游离小孢子培养体系，但不同种间游离小孢子胚诱导各有其自身的规律，并不能完全套用，为了解决上述技术问题，特提出一种新的技术方案。

发明内容

本发明提出菜心出胚数增加技术，特别说明了一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，通过游离小孢子制备及研究不同培养基类型、不同热激处理时间、培养基中添加不同浓度激素和活性炭对菜心小孢子胚状体诱导的影响，旨在找出菜心游离小孢子胚状体诱导发生的最佳培养条件，以提高出胚数，为建立菜心游离小孢子胚状体培养技术和利用现有资源快速创造所需要的新育种材料奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种提高菜心游离小孢子培养胚状体出胚数的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、试验材料，以20份菜心为试验材料，分别进行编号1～20，以珍珠岩为基质进行穴盘育苗，当幼苗长至三叶一心时，选取生长一致的健壮幼苗移栽到田间，常规栽培管理直至抽薹开花，于晴天上午采摘处于单核靠边期的花蕾进行游离小孢子培养，取样时主花序上的花蕾优先，其次为第一、第二分枝上的花蕾；

步骤二、小孢子游离，在无菌台上，将挑选好的花蕾放入烧杯中，用70％的酒精进行表面灭菌30s后，再用0.1％HgCl₂灭菌10～12min，接着用无菌水冲洗3次，每次冲洗5min，置于无菌圆底试管中加入少量的B5提取液，用玻璃棒将花蕾轻轻研碎，使小孢子游离到提取液中。再通过50μm孔径尼龙网除去花蕾组织碎片，收集滤液于10mL离心管中，滤液经900r/min离心3min，弃上清，再用B5提取液重新悬浮小孢子后再离心，如此重复3次，最后将所得小孢子沉淀用NLN液体培养基悬浮，用血球计数板将小孢子密度调整为1×10⁵～2×10⁵个/mL，分装至75mm培养皿中，用Parafilm封口；