[发明专利]基于去SUMO化酶和SAX的SUMO化肽段富集方法

权利要求书

1.基于去SUMO化酶和阴离子交换色谱SAX的SUMO化肽段富集方法，步骤包括：

1）封闭多肽中N末端和侧链的自由氨基；所述的封闭多肽中N末端和侧链的自由氨基，具体步骤如下：

将蛋白质的碱性位点酶切后产生的多肽样品溶解于pH为6-10的缓冲液中，加入终浓度10-4000 mM的氨基活性试剂，反应1-48 h后，将溶液除盐，冻干，得到样品A；所述的蛋白质的碱性位点酶切采用的酶为胰蛋白酶，蛋白内切酶Lys-C，蛋白内肽酶Arg-C中的一种或二种以上；氨基活性试剂为醛类、酸酐类、卤化物、胍基化试剂、琥珀酰化试剂、Traut’s试剂中的一种或二种以上；

2）采用阴离子交换色谱SAX预富集多肽中保留的SUMO化肽段；

3）再对收集到的SUMO化肽段用去SUMO化酶进行去SUMO化；

4）将样品再一次经过阴离子交换色谱SAX，收集不保留的流份；

从而实现对SUMO化修饰肽段的二次富集。

2.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：

所述步骤2）的采用阴离子交换色谱SAX预富集多肽中保留的SUMO化肽段，具体步骤如下：

将所得的样品A采用A相溶解并上样到阴离子交换色谱柱上进行分离，先用含盐的摩尔浓度≤100 mM的流动相洗脱除去保留较弱的酶解肽段，然后采用含盐的摩尔浓度150 mM的流动相洗脱并收集保留较强的肽段流出液，将溶液除盐，冻干，得到样品B；

流动相按体积百分浓度计， A相：5-30%有机溶剂+1-50 mM碱的水溶液；B相： 5%-30%有机溶剂+1-50 mM 碱的水溶液+ 200-1000 mM 盐；

所述的有机溶剂包括乙腈、醇类、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、醚类、丙酮、吡啶、氯仿中的一种或二种以上；

所述的碱的水溶液为pH为8-14的碳酸氢铵缓冲盐溶液、pH为8-14的磷酸缓冲盐溶液、pH为8-14的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液、氨水、碳酸钠溶液、或氢氧化钠溶液中的一种或二种以上配置而成；

所述的盐包括阳离子为钾、钠中的一种或二种以上的卤素盐、磷酸盐、硝酸盐、羧酸盐、碳酸盐、硫酸盐中的一种或二种以上；

所述步骤3）的对收集到的SUMO化肽段用去SUMO化酶进行去SUMO化，具体步骤如下：

将所得的样品B溶于pH为4-10的缓冲液，加入去SUMO化酶进行去SUMO化反应，去SUMO化酶用量为肽段的100/1-1/100，酶解时间为2-72 h，酶解温度16-56 ℃，得到溶液C；

所述步骤4）的将样品再一次经过阴离子交换色谱SAX，收集不保留的流份，具体步骤如下：

将所得的溶液C上样到阴离子交换色谱柱，用步骤（2）的A相洗脱，收集存在于A相洗脱流出液中的不保留的酶解肽段，即为富集后的去SUMO化修饰的底物肽段。

3.按照权利要求2 所述的方法，其特征在于：

所述的pH为6-10缓冲液包括磷酸二氢钠、碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三乙二胺碳酸盐、2-(N-吗啡啉)乙磺酸、磷酸氢二钠中的一种或二种以上配置而成；缓冲液浓度为10-500 mM；

氨基活性试剂的醛类为甲醛、乙醛中的一种或二种以上，酸酐类为乙酸酐、丙酸酐中的一种或二种以上，卤化物为碘乙酰胺、氯乙酰胺中的一种或二种以上，胍基化试剂为O-甲基异脲、1-H-吡唑甲脒盐酸盐中的一种或二种以上，琥珀酰化试剂为琥珀酰亚胺酯类中的一种或二种以上；

当采用醛类试剂时，另外加入终浓度为10-600 mM的氰基硼氢化钠。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤3）所述的去SUMO化酶为SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6、SENP7、SENP8中的一种或二种以上。

5.按照权利要求1所述的方法在生物样品中SUMO化修饰蛋白以及肽段的富集和鉴定中的应用；生物样品为人或动物或植物的细胞、组织、体液中的一种或二种以上。