[发明专利]基于去SUMO化酶和SAX的SUMO化肽段富集方法

说明书

本发明涉及一种基于去SUMO化酶和阴离子交换色谱的SUMO化修饰肽段的富集方法，首先将蛋白质样品的碱性位点酶解成多肽，在肽段水平封闭肽段的N末端和侧链的自由氨基，然后采用阴离子交换色谱预富集多肽中保留较强的SUMO化肽段，再对收集到的SUMO化肽段用去SUMO化酶进行去SUMO化，发生去SUMO化后的肽段在阴离子交换色谱中的保留将变弱，将样品再一次经过阴离子交换色谱，收集不保留的流份，通过将去SUMO化修饰的底物肽段与其他干扰肽段分离，实现对SUMO化修饰肽段的二次富集。本发明的优点是选择性高、富集效率高、可同时富集多类型的SUMO化修饰肽段、提高了SUMO化修饰位点的鉴定覆盖度。

技术领域

本发明涉及SUMO化肽段的富集方法，即一种基于去SUMO化酶和阴离子交换色谱(SAX)的SUMO化修饰肽段的富集方法，以实现复杂蛋白质样品SUMO化肽段的高效和高选择性富集。

背景技术

泛素化修饰是生物体内常见的翻译后修饰之一，也是最早发现的一种与蛋白质相连的修饰方式，在蛋白质降解方面发挥着重要作用。近十几年来科学家们相继发现了一些类泛素蛋白，其中小泛素相关修饰物(small ubiquitin-like modifiers,SUMO)是最受瞩目的一类。

SUMO在多个细胞生理活动中都发挥着重要的调节作用，例如维持基因组稳定性、调节细胞周期、调控细胞分化和转录因子活性、参与信号转导等。许多SUMO修饰蛋白如转录因子在细胞中的丰度很低，并且在正常状态下只有小部分蛋白质底物被修饰。在进行质谱分析时，复杂样品中蛋白质的浓度范围很广，高丰度的蛋白质会对低丰度SUMO修饰蛋白质质谱信号产生抑制。此外，在对蛋白质SUMO修饰多肽(位点)进行分析时，SUMO修饰蛋白质酶解产物中大量的非修饰肽段对SUMO修饰肽段产生极大干扰。上述因素严重影响了SUMO修饰蛋白及其修饰位点的鉴定和定量效率。

为了提高对SUMO修饰的鉴定效率，人们发展了多种基于生物标记的富集方法。通常是对SUMO进行His-tag标记或者变异后，利用Ni-NTA或者抗体对SUMO修饰蛋白和多肽进行亲和富集(Nature Communication 2017,8,14109；Nature StructuralMolecularBiology 2017,24,325-336；Nature Communication 2015,6,7289)。此类方法有助于提高对SUMO修饰的鉴定效率，但是只适用于基因可改变的生物样品(如细胞)，对于组织、血液等样品则无能为力；此外，对SUMO序列进行改变可能影响SUMO的性质和功能，因此无法准确反映样品中蛋白质的真实修饰状态。最近陆续发表的几篇文章已被报导可成功鉴定到人源细胞与小鼠组织中的内源性SUMO化肽段(Nature Communication 2018,9,2456；NatureCommunication 2017,8,1171；MolecularCellular Proteomics 2017，16，717-727)，但是仍然依赖于价格昂贵的抗体对SUMO修饰多肽进行亲和富集，且只能针对一类SUMO修饰肽段进行富集。因此，亟需发展一种普适性的用于内源型SUMO修饰蛋白质及修饰多肽的富集方法。

为克服以上方法所存在的问题，建立一种高效的普适性的富集方法，我们利用碱性位点酶切后的SUMO化肽段具有多酸性氨基酸的特征，结合去SUMO化酶和阴离子交换色谱实现对非SUMO化肽段的高效去除，提高SUMO化肽段富集的选择性和效率。

发明内容

本发明发展了一种基于去SUMO化酶和阴离子交换色谱的SUMO化修饰肽段的富集方法，操作步骤简单方便、选择性高、富集效率高

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1)封闭多肽中N末端和侧链的自由氨基

将蛋白质的碱性位点酶切后产生的多肽样品溶解于pH为6-10的缓冲液中，加入终浓度10-4000mM的氨基活性试剂，反应1-48h后，将溶液除盐，冻干，得到样品A；