[发明专利]一种高效的云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法

权利要求书

1.一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）云锦杜鹃无菌播种苗的准备：云锦杜鹃的种子表面消毒后播种于培养基中，温度25℃，光照强度80μmol·m^-2·s^-1的组培室中培养2-3个月，获得云锦杜鹃无菌播种幼苗待用；

（2）叶片体细胞胚胎的诱导：在超净工作台中，取步骤（1）制备的云锦杜鹃幼苗顶端的2-4片嫩叶，用刀片切除叶片两端，正面朝上，将叶片平放于配置好的体细胞胚胎发生诱导培养基表面，每个平板放四个叶片，用封口膜封好后黑暗培养2个星期，温度25℃；然后放置于培养室中培养，温度25℃，16h光照8h黑暗，光照强度80μmol·m^-2·s^-1，培养时间80-100d；期间观察叶片体细胞胚胎发生的过程，对体细胞胚胎发生的四个典型阶段：球形胚，心形胚，鱼雷形胚和子叶形胚进行拍照记录，并统计体细胞胚胎发生率、转化率以及平均每个外植体的成苗数；

（3）移栽及光水管理：将步骤（2）的小植株从外植体中剥离，移栽到穴盘中，后进行喷雾，湿度80%-90%，培养20d后停止喷雾，保持通风良好和遮光处理；水肥管理为每周浇2-3次水，每周浇一次浓度为200ppm 的20-20-20水溶性肥料；

步骤（1）中所述培养基的组成为：1/2 ER培养基+15g/L的蔗糖+8g/L的琼脂，pH为5.0 -5.2之间；

步骤（2）中，所述体细胞胚胎发生诱导培养基的配置方法为：WPM+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH值调至5.0-5.2，121℃高压30min，冷却到50-60℃后添加过滤灭菌的植物生长调节剂：TDZ0.5 mg/L和NAA0.2 mg/L，将培养基分装至培养皿中凝固待用，25ml每个培养皿；

步骤（3）所述的穴盘中装栽培基质，小植株移栽前用营养液浇透穴盘内的基质后进行移栽；所述栽培基质的制备方法为：沙子先用自来水冲洗数遍，然后自来水浸泡三天，中间换3~5次水，最后风干备用，将草炭和备好的沙子按2：1的体积比混合后分装于96孔标准穴盘中；所述营养液的配方为：CaCl₂·2H₂O 0.05g/L, NaCl 0.025g/L, MgSO₄·7H₂O 0.15g/L,（NH₄）₂HPO₄ 0.25g/L, KH₂PO₄ 0.5g/L, 柠檬酸0.2g/L, 维生素B1 0.1mg/L，葡萄糖 15g/L，调节pH至5.0 -5.2。