[发明专利]一种高效的云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法有效
申请号: | 201911216208.6 | 申请日: | 2019-12-02 |
公开(公告)号: | CN110896860B | 公开(公告)日: | 2021-07-27 |
发明(设计)人: | 魏翔莺;张春英;郑秀霞;穆景利 | 申请(专利权)人: | 闽江学院 |
主分类号: | A01H4/00 | 分类号: | A01H4/00 |
代理公司: | 福州元创专利商标代理有限公司 35100 | 代理人: | 饶文君;蔡学俊 |
地址: | 350108 福建省*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 高效 云锦 杜鹃 直接 体细胞 胚胎 发生 方法 | ||
1.一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)云锦杜鹃无菌播种苗的准备:云锦杜鹃的种子表面消毒后播种于培养基中,温度25℃,光照强度80μmol·m-2·s-1的组培室中培养2-3个月,获得云锦杜鹃无菌播种幼苗待用;
(2)叶片体细胞胚胎的诱导:在超净工作台中,取步骤(1)制备的云锦杜鹃幼苗顶端的2-4片嫩叶,用刀片切除叶片两端,正面朝上,将叶片平放于配置好的体细胞胚胎发生诱导培养基表面,每个平板放四个叶片,用封口膜封好后黑暗培养2个星期,温度25℃;然后放置于培养室中培养,温度25℃,16h光照8h黑暗,光照强度80μmol·m-2·s-1,培养时间80-100d;期间观察叶片体细胞胚胎发生的过程,对体细胞胚胎发生的四个典型阶段:球形胚,心形胚,鱼雷形胚和子叶形胚进行拍照记录,并统计体细胞胚胎发生率、转化率以及平均每个外植体的成苗数;
(3)移栽及光水管理:将步骤(2)的小植株从外植体中剥离,移栽到穴盘中,后进行喷雾,湿度80%-90%,培养20d后停止喷雾,保持通风良好和遮光处理;水肥管理为每周浇2-3次水,每周浇一次浓度为200ppm 的20-20-20水溶性肥料;
步骤(1)中所述培养基的组成为:1/2 ER培养基+15g/L的蔗糖+8g/L的琼脂,pH为5.0 -5.2之间;
步骤(2)中,所述体细胞胚胎发生诱导培养基的配置方法为:WPM+30g/L蔗糖+8g/L琼脂,pH值调至5.0-5.2,121℃高压30min,冷却到50-60℃后添加过滤灭菌的植物生长调节剂:TDZ0.5 mg/L和NAA0.2 mg/L,将培养基分装至培养皿中凝固待用,25ml每个培养皿;
步骤(3)所述的穴盘中装栽培基质,小植株移栽前用营养液浇透穴盘内的基质后进行移栽;所述栽培基质的制备方法为:沙子先用自来水冲洗数遍,然后自来水浸泡三天,中间换3~5次水,最后风干备用,将草炭和备好的沙子按2:1的体积比混合后分装于96孔标准穴盘中;所述营养液的配方为:CaCl2·2H2O 0.05g/L, NaCl 0.025g/L, MgSO4·7H2O 0.15g/L,(NH4)2HPO4 0.25g/L, KH2PO4 0.5g/L, 柠檬酸0.2g/L, 维生素B1 0.1mg/L,葡萄糖 15g/L,调节pH至5.0 -5.2。
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