[发明专利]一种高效的云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法

说明书

本发明公开了一种高效的云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法，属于植物快速繁殖再生技术领域。本发明首次建立云锦杜鹃的高效体细胞胚胎发生系统，以云锦杜鹃实生苗叶片为外植体的体细胞直接胚胎发生再生植株，是一种高效的获得大量云锦杜鹃组培苗的无性繁殖方式。本发明完善了常绿杜鹃花亚属植物组培快繁体系，解决了传统的播种耗时长且容易产生变异和扦插繁殖系数很低的难题。该方法能够快速繁殖大量性状稳定的植株，快速建立优良单株的无性系，在云锦杜鹃种苗生产、种质创新和新品种选育方面均有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于植物快速繁殖再生技术领域，具体涉及一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法。

背景技术

云锦杜鹃作为杜鹃花科植物的重要亲本，具有很高的观赏价值，极其耐寒且具有香气。传统的繁殖方式为种子播种或者茎段扦插，但是育种周期长且效率低，所以通过离体培养再生植株是一种高效且快速大量繁殖植株的方法。云锦杜鹃为木本植物，植物体中含有较多的多酚类物质会阻碍细胞分裂，因此其再生系统的建立比较困难，通过体细胞胚胎发生再生的方案尚未建立。

胚性细胞具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化感受态细胞，由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来的体细胞胚多数是单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少，是最理想的基因转化受体系统。故建立体胚发生系统在云锦杜鹃种苗生产、种质创新和新品种选育方面均有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于针对云锦杜鹃现有种子繁殖和扦插繁殖时间慢且容易产生变异的问题，提供一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效云锦杜鹃直接体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：

（1）云锦杜鹃无菌播种苗的准备：云锦杜鹃的种子表面消毒后播种于培养基中，温度25℃，光照强度80mol.m^-2.s^-1的组培室中培养2-3个月，获得云锦杜鹃无菌播种幼苗待用；

（2）叶片体细胞胚胎的诱导：在超净工作台中，取步骤（1）制备的云锦杜鹃幼苗顶端的2-4片嫩叶，置于湿润的无菌滤纸上，用刀片切除叶片两端，正面朝上，将叶片平放于配置好的体细胞胚胎发生诱导培养基表面，每个平板放四个叶片，用封口膜封好后黑暗培养2个星期，温度25℃；然后放置于培养室中培养，温度25℃，16h光照8h黑暗，光照强度80 lmolm^-2s^-1，培养时间80-100 d；期间观察叶片体细胞胚胎发生的过程，对体细胞胚胎发生的的四个典型阶段：球形胚，心形胚，鱼雷形胚和子叶形胚进行拍照记录，并统计体胚发生率及其转化率以及平均每个外植体的成苗数；

（3）移栽及光水管理：将将步骤（2）的小植株从外植体上剥离，移栽到穴盘中后进行喷雾培养，湿度80%-90%，20d后停止喷雾，保持通风良好和遮光处理；水肥管理为每周浇2-3次水，每周浇一次20-20-20水溶性肥料（浓度为200ppm）。

上述步骤（1）中所述培养基的组成为：1/2 ER培养基+15g/L的蔗糖+8g/L的琼脂，pH为5.0 -5.2之间。

上述步骤（2）中，所述体细胞胚胎发生诱导培养基的配置方法为：木本植物培养基WPM+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH值调至5.0-5.2，121℃高压30min，冷却到50-60℃后添加过滤灭菌的植物生长调节剂：TDZ （噻苯隆）0.5 mg/L和NAA（萘乙酸）0.2 mg/L，将培养基分装至培养皿中凝固待用（25ml每个培养皿）。