[发明专利]一种核糖体印迹测序文库构建方法

说明书

本发明提供了一种核糖体印迹测序文库构建方法。本发明的文库构建方法包括如下步骤：(1)提取样品的RFP‑RNA；(2)修复RFP‑RNA的两端结构；(3)将正常结构的RNA采用small RNA建库试剂盒进行文库构建。本发明将RFP‑RNA双端修复，使其恢复成正常的RNA结构，能够和市面上的small RNA试剂盒无缝衔接，直接建库，无需去除rRNA，无需采用复杂的RFP‑RNA建库方法，简化了建库实验步骤，降低了物资成本，提高了实验的稳定性；减少了4～5天的实验时间，降低了50％的时间成本。本发明的文库构建方法适用于各类物种；得到的测序数据质量高，和理论水平一致。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种核糖体印迹测序文库构建方法。

背景技术

核糖体印迹测序(Ribosome profiling、Ribo-seq、RFP、RPF)技术由Ingolia等(Ingolia,N.T.,Ghaemmaghami,S.,Newman,J.R.Weissman,J.S.Genome-wide analysisin vivo of translation with nucleotide resolution using ribosomeprofiling.Science 324,218–223(2009).)于2009年首次发表。该技术使用核酸酶对生物样品裂解产物中的非核糖体保护的RNA进行酶切，经过超速离心纯化后得到单核糖体及其保护的RNA片段，使用Trizol提取RNA，再使用尿素丙烯酰胺凝胶电泳纯化得到18nt-35nt的RFP-RNA，最后通过二代测序手段构建测序文库，对核糖体保护的RNA片段(18-35nt)进行测序，获取在某一生理条件下生物体内所有核糖体在RNA上的具体位置信息。高精度的ribosome profiling数据可以对翻译阅读框进行系统性的重新注释、计算蛋白质合成速率、发现翻译暂停位点、翻译延伸核糖体结构、正在翻译的mRNA定性定量等研究。

由于核糖体印迹测序技术路线复杂、实验难度大、实验成本极高，因此目前做出高精度的核糖体印迹测序数据依然是一项挑战。主要难点在于酶切条件的确定和文库构建，酶切条件的困难点在于生物样品的多样性及复杂性，目前主要依赖经验判断，实验流程上没有太多改善的空间，而建库方法流程目前的改进空间非常大。由于RFP-RNA的结构与正常small RNA不同，无法使用常规Small RNA建库试剂盒进行建库，目前并无方法能够将RFP-RNA建库与常规Small RNA建库试剂盒衔接。Ingolia于2012发表的方法文献(Ingolia NT,Brar GA,Rouskin S,McGeachy AM,Weissman JS(2012)The ribosome profilingstrategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.Nat Protoc 7(8):1534–1550.)中的建库方法需要研究者自己合成大量的带修饰测序引物及接头序列、购买大量试剂用于文库构建中的酶促反应及核酸纯化，其中的rRNA去除步骤所用试剂十分昂贵，需要额外定制探针，无法适用于各种物种，且去除效率非常低。核糖体印迹测序实验时间极长(大约需要7-8天)，过于繁琐的建库流程增加了实验的难度及成本，许多研究者消耗了大量时间和金钱却无法得到合格的数据。因为核糖体印迹测序技术的优化需要极高的成本，绝大部分实验室没有能力对该方法不足之处进行优化。这些因素极大的限制了核糖体印迹测序的技术发展与推广，因此，目前核糖体印迹测序技术急需一个可以标准化、操作简便同时具有高稳健性的建库方案。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种核糖体印迹测序文库构建方法。该方法将RFP-RNA修复成正常的RNA结构，可以使用市面上常见的Small RNA建库试剂盒进行建库，无需自行构建复杂的RFP-RNA建库流程，显著降低核糖体印迹测序的实验成本、难度及时间消耗。

本发明的另一目的在于提供上述方法构建的核糖体印迹测序文库。