[发明专利]一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应方法

说明书

本申请基因检测领域，公开了一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应方法。本发明所述添加剂由二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween‑20、海藻糖组成，可以有效降低引物探针Tm值。本发明所述快速检测DNA的实时定量PCR，其反应体系含有所述的添加剂，引物Tm值在65‑70℃之间，探针Tm值在75‑85℃之间，反应程序为92‑95℃×1min‑3min；80‑85℃×5s‑15s，65‑75℃×10s‑22s，35‑45循环。通过优化PCR反应体系中引物探针Tm值和添加剂组分，减少PCR反应步骤，同时降低PCR不同步骤之间温度差，缩短PCR扩增时间，使PCR反应更加快速高效。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。1983年，美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。PCR的原理是利用DNA在体外95℃高温时变性成为单链，低温(退火)(通常为55-60℃)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向以dNTP为原料合成互补链。

运用PCR技术在体外能将指定基因以及DNA序列迅速扩增，最先应用此技术是基因克隆以及检测转基因，随着人们对食物微生物遗传性质的不断了解，进一步明确大部分致病菌的遗传条件，PCR技术也逐渐应用在食品检测中。PCR检测技术在食品检测中的应用主要包括食品中成分种类的检测、食品中有效成分的检测、转基因食品的鉴定和食源性致病菌的检测。PCR检测技术可以用于水体微生物的检测。近几年来，人们广泛关注病原微生物，由此，PCR技术也逐渐应用于水体微生物的检测，尤其是对生活水的微生物检测。PCR检测技术还可以用于食品样品中致病菌的检测。

传统的PCR扩增模式主要有两种程序：(1)三段式。设置三个温度点，依次进行变性(95℃，20-30s)退火(50-60℃，30-50s)、延伸(72℃，1-2min)三个过程，三个温度间温差大，在经过多个循环此种模式的升降温过程中耗时长。(2)两段式。设置两个温度点，依次进行变性(95℃，20-30s)、退火+延伸(60-65℃，1-2min)两个过程，这两种PCR扩增模式由于不同步骤间温差大，在经过多个循环此种模式的扩增升降温过程中耗时长，完成整个PCR扩增普遍用时90min-120min。如果仅仅合成35～100bp左右的序列，引物退火温度的要求范围可以高于或者低于理论温度5～10℃，在保证特异性的前体下，合并退火与延伸温度，用两段式PCR可比用严格三温度转换更能提高反应速度。

实时定量PCR技术(Real-time RT-PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。实时荧光PCR反应具有检测方法灵敏度高、特异性强的优点，在体外诊断和食品检测中应用越来越广泛。但该方法在实际使用中出现工作效率不高，通常流程为反复升降温的PCR过程，反应时间通常需要1～2小时，耗时长，难以满足大批量快速检测的需求。因此，亟需一种快速的PCR扩增检测方法满足市场需求。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种快速检测DNA的PCR反应方法，实现高效、快速检测DNA的目的。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：