[发明专利]斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法有效
| 申请号： | 201911219814.3 | 申请日： | 2019-12-03 |
| 公开（公告）号： | CN111100953B | 公开（公告）日： | 2022-12-20 |
| 发明（设计）人： | 赵哲;郝凯;史燕;喻飞 | 申请（专利权）人： | 河海大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 | 代理人： | 刘妍妍 |
| 地址： | 210098 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 斑点 叉尾鮰 疱疹病毒 lamp 检测 引物 试剂盒 方法 | ||
1.一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组，还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照、阴性对照和显色剂SYT0-9；
所述斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；
所述外引物包括ORF77-F3序列和ORF77-B3序列，所述外引物ORF77-F3序列如SEQ IDNO:1所示，所述外引物ORF77-B3序列如SEQ ID NO:2所示；
所述内引物包括ORF77-FIP序列和ORF77-BIP序列，所述内引物ORF77-FIP序列如SEQID NO:3所示，所述内引物ORF77-BIP序列如SEQ ID NO:4所示；
所述环引物包括ORF77-LF序列和ORF77-LB序列，所述环引物ORF77-LF序列如SEQ IDNO:5所示，所述环引物ORF77-LB序列如SEQ ID NO:6所示；
所述外引物、内引物与环引物的摩尔比为1:8:4。
2.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液包括：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液，三者的体积比为8:5:2。
4.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为将ORF77片段序列连接到T载体中得到的质粒，所述ORF77片段序列如SEQ ID NO:7所示；所述阴性对照为超纯水。
5.权利要求1所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：
从待检测斑点叉尾鮰组织中提取DNA；
采用权利要求1所述的引物组对提取到的DNA进行恒温基因扩增反应；
根据扩增结果判断样品是否具有斑点叉尾鮰疱疹病毒。
6.根据权利要求5所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，结果判断方法为：将反应管放置在实时荧光定量PCR仪中进行反应，观察实时荧光定量PCR仪判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
7.根据权利要求5所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述恒温基因扩增反应按照下述反应体系进行：扩增反应体系含有：ORF77-F3 0.2μM， ORF77-B30.2μM，ORF77-FIP 1.6μM，ORF77-BIP 1.6μM，ORF77-LF 0.8μM，ORF77-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-9 0.5μl，待检DNA 1~100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照。
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