[发明专利]斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测的LAMP引物组、试剂盒及其检测方法，属于水产养殖病害防控领域。所述试剂盒由LAMP引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。所述LAMP引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物。检测试剂盒在斑点叉尾鮰疱疹病毒检测中的应用步骤包括：斑点叉尾鮰疱疹病毒DNA的制备、恒温基因扩增反应以及通过实时荧光定量PCR仪进行结果判断。本发明的试剂盒具有操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高和结果可靠等优点，能在斑点叉尾鮰疱疹病毒病早期快速诊断和实时监测方面发挥重要作用，适合斑点叉尾鮰养殖现场对病原快速检测使用。

技术领域

本发明属于水产养殖病害防控领域，涉及水产养殖动物病原的分子检测方法，具体涉及一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

斑点叉尾鮰(Letalurus Punetaus)，原产于北美，是一种温水性的淡水养殖鱼类，1984年引入中国后，养殖面积和总产量不断增加，目前已在我国20多个省份养殖，2016年总产量达28.5万吨，我国已经成为世界最主要的斑点叉尾鮰养殖国家之一。斑点叉尾鮰病毒(Channel Catfish Virus，CCV)是一种有囊膜的双链DNA病毒，又称鮰疱疹病毒I型(Ictalurid herpesvirus 1)，能够对斑点叉尾鮰鱼苗和鱼种造成致死性感染。随着斑点叉尾鮰养殖规模的不断扩大，集约化程度日益提高，养殖环境恶化，斑点叉尾鮰病害日趋严重，特别是由斑点叉尾鮰病毒(CCV)引起的斑点叉尾鮰疱疹病毒病(Channel CatfishVirus Disease，CCVD)危害最大，给斑点叉尾鮰养殖业造成严重的经济损失。

目前，CCVD的传统检测方法主要是采用细胞培养技术进行CCVD的诊断，然后结合血清中和试验、荧光抗体技术、ELISA或PCR鉴定，以上方法虽然准确可靠，但需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于斑点叉尾鮰现场普及推广使用。

发明内容

本发明的目的在于公开一种斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。本研究以斑点叉尾鮰CCVD病原的ORF77保守基因序列设计LAMP引物，以实时荧光定量PCR仪为恒温反应及检测平台，通过吸收荧光来实时判断反应的进行，建立一种对CCVD病原的LAMP检测试剂盒和检测方法。该检测方法能快速、特异检测ORF77基因的存在，从而准确确定检测样品中是否存在CCVD病原，比传统的通过浊度或颜色变化来判断LAMP结果更加客观可靠；该检测方法的检测平台可使用国产恒温荧光检测仪，该仪器便携、易操作，相比定量PCR仪，节约了大量成本；综述所述，本研究建立的方法能特异、快速检测CCVD病原，能在斑点叉尾鮰疱疹病毒病早期快速诊断和实时监测方面发挥重要作用，同时适合斑点叉尾鮰养殖现场快速检测使用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的LAMP检测引物组，所述引物包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；

所述外引物包括ORF77-F3序列和ORF77-B3序列，所述外引物ORF77-F3序列如SEQIDNO:1所示，所述外引物ORF77-B3序列如SEQ ID NO:2所示；

所述内引物包括ORF77-FIP序列和ORF77-BIP序列，所述内引物ORF77-FIP序列如SEQ ID NO:3所示，所述内引物ORF77-BIP序列如SEQ ID NO:4所示；

所述环引物包括ORF77-LF序列和ORF77-LB序列，所述环引物ORF77-LF序列如SEQIDNO:5所示，所述环引物ORF77-LB序列如SEQ ID NO:6所示。

进一步的，所述外引物、内引物与环引物的摩尔比为1:8:4。