[发明专利]水稻OsNramp5-18

权利要求书

1.一种水稻OsNramp5^-18突变型基因，其特征在于，所述OsNramp5^-18突变型基因相比日本晴水稻的OsNramp5基因序列，包含有以下碱基缺失段，即：

在8875646-8875663位置(RAP_Locus)存在[CCTACGTGGCAATTCACA/-]18个bp的缺失。

2.根据权利要求1所述的水稻OsNramp5^-18突变型基因，其特征在于，其具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，或其截短序列，或与其有95％以上同源性的编码相同功能蛋白的特异性序列。

3.一种从理化诱变样本中鉴定是否含权利要求1或2所述水稻OsNramp5^-18突变型基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)通过非致死剂量的理化诱变方式对水稻进行诱变，获得水稻材料M1代；

b)将获得的M1代的植株分单株进行种植，并取各种植后单株上的叶片，将各单株的叶片混合；

c)对混合后的全部叶片材料提取出混池DNA；

d)对提取的混池DNA进行水稻OsNramp5基因区域的高深度靶向测序；

e)将高深度靶向测序结果与所述水稻OsNramp5^-18突变型基因的相关序列进行比对，鉴定高深度靶向测序结果中的群体性DNA样品是否存在水稻OsNramp5^-18突变型基因；

如果含有水稻OsNramp5^-18突变型基因则可进行后续筛选操作获得相应突变体，否则终止操作。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述后续筛选操作还包括利用以下任意一种或多种方式对所述步骤e)的鉴定结果进行验证，验证样品中是否存在水稻OsNramp5^-18突变型基因，所述验证方式具体包括：

e₁：数字PCR鉴定方式对全部植株进行检测验证；

e₂：通过KASP分型方式对每个单株进行分型验证；

e₃：通过一代测序方式对每个单株进行验证。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述验证方式包括以下两步：

1)先采用数字PCR鉴定方式对高深度靶向测序结果中的群体性DNA进行检测，鉴定群体性DNA样品中是否存在OsNramp5^-18基因的目标SNP和/或Indel；若存在则执行以下第2)步，否则终止；

2)再针对数字PCR鉴定存在的SNP和/或Indel位点，利用KASP分型引物，对含有该突变的混池样本所对应的群体，分单株进行KASP基因分型，最终确定是否含有水稻OsNramp5^-18突变型基因的嵌合体单株。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述KASP分型的分型引物包含以下序列：

FAM 5-’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAACCTGCACCCGTCCT-’3；

HEX 5-’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGAACCTGCACCCGTCAC-’3；

COMMON 5-’GCATGGAAAGAAACTGAACAAAGAT-’3。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述后续筛选操作还包括以下步骤：

f)对鉴定出含有OsNramp5^-18突变型基因的嵌合体单株，提取其每个穗子对应叶片的DNA进行DNA鉴定，选择含有该突变的穗子，并混收其种子；

g)对于混收的种子进行混播，然后分单株提取叶片并进行DNA鉴定，最终获得具有OsNramp5^-18突变型基因遗传表型的突变体。