[发明专利]一种细胞松弛素类化合物的制备方法和应用

权利要求书

1.一种细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于：所述细胞松弛素类化合物为细胞松弛素C和细胞松弛素D，是通过广豆根内生真菌炭角菌GDGJ-368发酵得到，所述炭角菌GDGJ-368的保藏号为CCTCC M2019951；所述细胞松弛素类化合物是通过将炭角菌GDGJ-368接种在大米培养基中发酵，将发酵液通过硅胶柱层析分离得到的；具体包括以下步骤：

(1)配制种子培养基，将所述炭角菌GDGJ-368接种到PDA平板培养基，培养后得到种子培养基；

(2)将步骤(1)得到的种子培养基切割后接种至灭菌后的大米培养基中发酵，发酵培养得发酵物，而后将发酵物用有机溶剂浸泡提取，减压浓缩之后得到粗浸膏；

(3)步骤(2)得到的粗浸膏经过硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，所述石油醚-乙酸乙酯梯度范围为：10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、0:10；合并7:3和5:5梯度洗脱得到的馏分，浓缩后经反相C18柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析，再进行重结晶，即得到细胞松弛素C和细胞松弛素D。

2.根据权利要求1所述一种细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于：所述PDA平板培养基主要由以下原料制成：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15～20g/L；培养条件为28℃恒温培养4-6天。

3.根据权利要求1所述一种细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的发酵条件为，在每个大米培养基中接种一块蚕豆大小的菌体，室温条件下静置培养25-50天；所述大米培养基中所含的组分包括：大米50-90g，蒸馏水120-150mL。

4.根据权利要求1所述一种细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的发酵物为固体，所述有机溶剂为乙酸乙酯，提取次数为1-5次，将每次的提取液合并后减压浓缩得到粗浸膏。

5.根据权利要求1所述一种细胞松弛素类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，具体步骤还包括，合并7:3和5:5梯度洗脱得到的馏分后，浓缩至干得固体B；

将固体B拌样过硅胶柱，使用石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂以体积比为9:1、7:3、5:5、3:7、0:10梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比7:3洗脱的部分，浓缩后，得到固体C；收集石油醚-乙酸乙酯体积比5:5洗脱的部分，浓缩后，得到固体D；

固体C使用反相C18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，使用甲醇重结晶得到细胞松弛素C；

固体D使用反相C18柱纯化，用体积比7:3的甲醇-水洗脱并收集洗脱物，浓缩后通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20纯化，洗脱剂为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇溶液，得到细胞松弛素D。