[发明专利]姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法及其应用，本发明制备的圆瓣姜花、姜花、红姜花等姜花属植物的中期染色体装片，每片的分裂相在20个以上，再应用于CPD染色和FISH杂交实验，CPD染色显示染色带纹较清晰，染色体之间有差异性，同一染色体不同部位带纹也不完全一致，45S rDNA FISH杂交信号清晰，检出率高达90％以上。

技术领域：

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法及其应用。

背景技术：

姜花属(Hedychium Koen)是姜科多年生草本植物，全世界有约50个种，中国28个种，其中特有种18个。姜花属植物有许多种重要的传统药用植物，如《中华大词典》记载的草果和姜花，主治胃寒痛、消化不良等，《四川中药志》记载的土羌活，主治风湿筋骨疼痛及跌打损伤等，还有毛姜花可祛风止咳，黄白姜花有解表散寒、利湿消肿、温胃止呕及消食健胃等功效。现代研究发现姜花属植物含有挥发油，可以用来提取香精。姜花属植物株型优美，花朵色彩艳丽，果序纷繁多样，极具园艺观赏价值。然而，姜花属植物遗传背景较模糊，形态变异复杂，导致其分类困难，物种数目不确定，物种进化关系不明朗。这影响了姜花属植物药用价值的开发利用和优良花卉品种的选育。高效制备姜花属植物的中期染色体，染色体数目、染色体核型分析，如4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)联合染色(CPD:Combined PI and DAPI)、荧光原位杂交(FISH:fluorescence in situ hybridization)定位分析等等细胞遗传信息，有助于姜花属植物的物种分类与进化的研究。

但是目前，姜花属植物染色体与核型分析的研究很少，所用的制备姜花属植物染色体的方法基本为压片法。姜花属植物资源多来源于野生环境，其根尖表面细胞有明显的木质化，细胞不易分离，使用常规压片法时，解离液效果往往不佳，要么是染色体易重叠,很难得到清晰的分裂相,要么是染色体结构变形，难以达到CPD染色和荧光原位杂交实验所需染色体的标准。压片法获得的染色体装片如要进行深入的分子细胞遗传学分析，还需利用液氮迅速冷后揭片，这一过程中容易出现装片断裂或盖玻片揭除不彻底的现象，无法进行后续实验。而利用常规酶解法和火焰干燥法制备姜花属植物中期染色体的过程中发现，染色体装片中杂质特别多，染色体分散性不好，重叠明显，荧光原位杂交实验中信号检出率极低。分析原因①姜花属植物根尖表面细胞木质化程度高，酶解法很难彻底分解。②火焰干燥法的敲片过程中，要求把材料敲碎，对木质化程度高的根尖生长点来说，该过程需要花费较长时间，且为了保持湿润需要多次加固定液，容易造成染色体的流失，使分裂相减少。③留在玻片上的非分裂相细胞相对增加，加上表皮细胞的残渣，使得杂交过程中探针很难与染色体结合，信号检出率自然低，杂交效果不佳。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法及其应用，本发明制备的圆瓣姜花、姜花、红姜花等姜花属植物的中期染色体装片，每片的分裂相在20个以上，再应用于CPD染色和FISH杂交实验，CPD染色显示染色带纹较清晰，染色体之间有差异性，同一染色体不同部位带纹也不完全一致，45S rDNA FISH杂交信号清晰，检出率高达90％以上。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：

一种姜花属植物根尖细胞染色体中期分裂相装片的方法，包括如下步骤：

步骤一、根尖的培养、采集和固定：种植姜花属植物植株至根长到1－1.5cm取根尖，将根尖置于预处理液中进行预处理，再用水漂洗后加入固定液固定得到固定好的根尖；

步骤二、根尖处理制片：

a)取固定好的根尖0.2-0.3cm左右，双蒸水清洗，再用柠檬酸缓冲液冲洗的导清洗后的根尖；