[发明专利]突变的L-氨基酸连接酶以及酶催化法制备L-谷氨酸-L-色氨酸二肽的工艺

说明书

本发明涉及生化技术领域，公开了突变的L‑氨基酸连接酶以及酶催化法制备L‑谷氨酸‑L‑色氨酸二肽的工艺。本发明所述突变的L‑氨基酸连接酶在野生型L‑氨基酸连接酶基础上具有H276G/S、W332K/N/Q/S、M334D/S、L12A/S、Y75S/G和W76L/V的位点突变。本发明在已知报道的非特异性L‑氨基酸连接酶研究的基础上，对其底物活性结合位点进行系统的氨基酸替换，最终得以实现L‑谷氨酸及L‑色氨酸的快速连接，同时结合辅酶ATP循环再生、固定化酶催化，一方面降低了生产成本，另一方面很好的提高了该二肽产品的品质及生产的稳定性，因而满足应用要求。

技术领域

本发明涉及生化技术领域，具体涉及突变的L-氨基酸连接酶以及酶催化法制备L-谷氨酸-L-色氨酸二肽的工艺。

背景技术

L-谷氨酸-L-色氨酸(Oglufanide)是由L-谷氨酸、L-色氨酸两种基本氨基酸通过Alpha位酰胺键连接而成的二肽,其分子式为C16H19N3O5,分子量为333.3,CAS号为122933-59-9。该二肽是一种治疗慢性丙型肝炎(Hepatitis C)感染时用的免疫调变剂(immunomodulator)，它也被用来在癌症的临床治疗过程中进行人体免疫反应的调节，同时也是一种抑制血管生成的药。

L-谷氨酸-L-色氨酸主要是通过化学合成法制备，同时市面上还存在少量的酶法及发酵法。化学合成多肽工艺大部分非常成熟，但在生产含有多个官能团的氨基酸(如含两个羧基的谷氨酸，两个氨基的赖氨酸)、含不稳定基团的氨基酸(如含巯基的半胱氨酸)以及水溶性差的氨基酸(如含苯环的色氨酸)组成的短肽产品时成本非常高，品质差，因而很难满足该二肽作为药物的高品质要求。

迄今为止，自然界还没有发现以L-谷氨酸及L-色氨酸为催化底物的氨基酸连接酶，因此在现有的酶催化制备工艺中主要利用非特异性蛋白水解酶在有机溶剂里的缩合实现，由于该酶缺少专一性，杂质短肽极大的影响了总体收率及最终产品纯化。发酵法生产L-谷氨酸-L-色氨酸二肽产品还停留在利用少量非特异性连接酶制备的实验阶段，由于转化效率低，副产物多，极大的限制了该方法的工业化应用。

自然界中存在不少的氨基酸连接酶，其中一类是L-氨基酸连接酶(Lal,EC6.3.2.49)，它能直接连接不同种L-氨基酸形成二肽。虽然有不少文献报道了部分LaI对L-谷氨酸及L-色氨酸有活性，但是迄今为止还没有发现能直接连接该氨酸酸成二肽的连接酶。由于L-氨基酸连接酶底物适应性很强，尤其是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)里的Lal(Uniprot ID:P39641)具有非常完整的酶催化及结构信息，这为该酶理性改造以适应L-谷氨酸、L-色氨酸生成相应二肽产品提供了很好的基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种突变的L-氨基酸连接酶，使其能够催化L-谷氨酸及L-色氨酸生成L-谷氨酸-L-色氨酸二肽，并具备较高收率；

本发明的另外一个目的在于利用上述突变的L-氨基酸连接酶，提供一种酶催化法制备L-谷氨酸-L-色氨酸二肽的工艺，可制备高收率的L-谷氨酸-L-色氨酸二肽。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种突变的L-氨基酸连接酶，在野生型L-氨基酸连接酶基础上具有H276G/S、W332K/N/Q/S、M334D/S、L12A/S、Y75S/G和W76L/V的位点突变。

本发明针对目前缺少专一性的以L-谷氨酸及L-色氨酸为催化底物的氨基酸连接酶的缺陷，在现有非特异性氨基酸连接酶的基础上进行位点突变改造，可特异性快速实现L-谷氨酸和L-色氨酸的连接，提高二肽的收率和生产效率。