[发明专利]一种原代调节性T细胞体外扩增体系及扩增方法

权利要求书

1.一种原代调节性T细胞的体外扩增体系，所述扩增体系是在基础培养基中加入抗CD3/28抗体、白细胞介素-2、Rapa和转化生长因子-β1配制而成，其中，抗CD3/28抗体终浓度为2μg/ml、白细胞介素-2终浓度为1000U/ml、Rapa终浓度为100-200ng/ml、转化生长因子-β1终浓度为4-8ng/ml；

所述基础培养基由1640培养基中添加胎牛血清、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇配制而成，在所述基础培养基中，胎牛血清体积浓度为10％、青霉素浓度为100U/ml、链霉素浓度为100μg/ml、丙酮酸钠摩尔浓度为1mM、非必需氨基酸摩尔浓度为0.1mM、β-巯基乙醇摩尔浓度为50μM。

2.根据权利要求1所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性T细胞的体外扩增体系中Rapa的浓度为100-150ng/ml，转化生长因子-β1的浓度为4-6ng/ml。

3.根据权利要求2所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性T细胞的体外扩增体系中Rapa的浓度为100ng/ml，转化生长因子-β1的浓度为4ng/ml或5ng/ml。

4.根据权利要求1所述的体外扩增体系，其特征在于，所述白细胞介素-2选自人白细胞介素-2或鼠白细胞介素-2。

5.根据权利要求4所述的体外扩增体系，其特征在于，所述白细胞介素-2为鼠白细胞介素-2。

6.根据权利要求1所述的体外扩增体系，其特征在于，所述的调节性T细胞选自人调节性T细胞或鼠调节性T细胞。

7.根据权利要求6所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性T细胞选自人外周血分离得到的调节性T细胞或小鼠脾脏分离得到的调节性T细胞。

8.根据权利要求7所述的体外扩增体系，其特征在于，所述原代调节性T细胞为小鼠脾脏分离得到的调节性T细胞。

9.一种利用权利要求1-8任一所述的原代调节性T细胞的体外扩增体系进行扩增的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)制备小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞；

(2)将步骤(1)制备的原代调节性T细胞悬于权利要求1-8任一所述的扩增体系中，按1×10⁵/孔接种于U型底96孔板，静置培养，每2天换一次液；

(3)第5天收集细胞，对细胞进行固定破膜后，染Foxp3抗体，检测Foxp3蛋白表达情况。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中制备小鼠脾脏单个核细胞并采用免疫磁珠两步法分选获得原代调节性T细胞。