[发明专利]一种原代调节性T细胞体外扩增体系及扩增方法

说明书

本发明公开一种原代调节性T细胞的体外扩增体系，所述扩增体系是在基础培养基中加入抗CD3/28抗体、白细胞介素‑2、Rapa和转化生长因子‑β1配制而成，其中，抗CD3/28抗体终浓度为2μg/ml、白细胞介素‑2终浓度为1000U/ml、Rapa终浓度为100‑200ng/ml、转化生长因子‑β1终浓度为4‑8ng/ml。与Rapa单用相比，Rapa与转化生长因子‑β1联合扩增体系中细胞稳定性更好，Foxp3⁺调节性T细胞纯度更高。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种原代调节性T细胞体外扩增体系及扩增方法。

背景技术

CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)是体内存在的最主要免疫抑制细胞，能有效抑制免疫反应、调节免疫平衡，其在移植耐受诱导、自身免疫疾病治疗等领域的研究和应用被广泛关注。

1995年Sakaguchi等研究发现小鼠缺失CD4⁺CD25⁺调节性T细胞会引发多种自身免疫性疾病，而将这些调节性T细胞回输则可抑制疾病的发生。调节性T细胞亚群在胸腺或由外周CD4+初始T细胞发育分化而来，可通过细胞间直接接触、分泌免疫抑制性细胞因子、竞争生长因子IL-2等方式抑制效应T细胞增殖和分化，发挥免疫调节功能。转录因子Foxp3作为调节性T细胞最重要的标志蛋白，其表达稳定与否深刻影响调节性T细胞的表型和功能。

近年研究发现，过继回输体内来源的天然调节性T细胞能有效诱导免疫耐受，成为抑制移植排斥、治疗自身免疫病的理想手段。但其在体内仅占外周CD4⁺的5-10％，通过分选获得的原代调节性T细胞数量少，难以满足过继回输诱导耐受的治疗需求。因此，建立稳定的原代调节性T细胞体外扩增方案是实现其临床应用的前提。

但是，目前原代调节性T细胞的体外培养仍存在以下问题：①调节性T细胞在体外表现出免疫无能，用常规培养基培养难以扩增，需加入活化因子抗CD3、CD28抗体(anti-CD3/28Ab)及白介素-2(IL-2)刺激细胞增殖；②采用免疫磁珠分选法能获得较高纯度的原代调节性T细胞，但仍有少量效应T细胞残留，其活化后分泌的炎性因子会导致调节性T细胞的转录因子Foxp3表达下调，显著降低扩增体系中调节性T细胞纯度；③已有研究表明雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)作为临床常用免疫抑制剂，可选择性抑制效应T细胞增殖，利于调节性T细胞体外扩增和Foxp3稳定表达，但实际效果有限。

在此背景下，本发明提供一种原代调节性T细胞体外扩增体系及扩增方法，通过优化调节性T细胞的体外培养方案，缓解原代调节性T细胞在体外活化培养时转录因子Foxp3丢失现象，维持扩增细胞的稳定性，为开发高效稳定的原代调节性T细胞体外扩增体系并实现其临床转化提供参考和依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种原代调节性T细胞体外扩增体系及扩增方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种原代调节性T细胞的体外扩增体系，所述扩增体系是在基础培养基中加入抗CD3/28抗体、白细胞介素-2、Rapa和转化生长因子-β1(TGF-β1)配制而成，其中，抗CD3/28抗体终浓度为2μg/ml、白细胞介素-2终浓度为1000U/ml、Rapa终浓度为100-200ng/ml、转化生长因子-β1终浓度为4-8ng/ml。

所述基础培养基由1640培养基中添加胎牛血清、青霉素、链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和β-巯基乙醇配制而成，在所述基础培养基中，胎牛血清体积浓度为10％、青霉素浓度为100U/ml、链霉素浓度为100μg/ml、丙酮酸钠摩尔浓度为1mM、非必需氨基酸摩尔浓度为0.1mM、β-巯基乙醇摩尔浓度为50μM。