[发明专利]用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物及其应用

说明书

本发明涉及一种用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物的制备和应用方法。将替代模板，交联剂、功能单体和引发剂溶于致孔溶剂中，制备成预聚合溶液，在50‑70℃下搅拌聚合反应24‑48h。聚合后得到聚合物经研磨、筛分后，得到粒径为10‑50μm的聚合物颗粒。得到的聚合物颗粒使用刻蚀剂或高温烧蚀的方法，去除替代模板，即得到替代模板印迹聚合物。该替代模板印迹聚合物对外泌体具有很强的特异选择性和富集能力。该材料在保证富集效果的同时，能够降低初始样品需求量，可用于复杂体系中外泌体的分离、富集和纯化。

技术领域

本发明涉及一种特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物及制备和应用，属于功能性生物材料和生物样品前处理领域。

背景技术

外泌体是一种细胞内源性的多囊泡体，可通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多囊泡内涵体，内涵体与细胞膜融合后释放其中的小囊泡形成，外泌体具有特征性脂质双层，其平均厚度为5nm，直径在40-100nm[11]。广泛存在于各种体液和组织中，携带脂质、蛋白和核酸等重要功能性成分[12]。自1983年首次在网织红细胞中发现外泌体以来，许多研究表明，外泌体是新形式的细胞间信息传递系统，其与细胞的生理状态、功能以及疾病的发生发展密切相关[5,13]。实现对外泌体的捕获与检测具有十分重要的意义。然而体液和细胞培养液中外泌体含量低，存在大量的干扰蛋白，为后续外泌体的生物学分析带来了巨大的挑战。

高效和高选择性的外泌体富集技术是开展外泌体研究的前提。目前，利用外泌体的物理化学和生物化学性质已经开发了许多用于分离尿液、血液等体液和细胞培养液中的外泌体技术。其中，超速离心技术是目前使用最广、所得外泌体纯度较高的分离和纯化方法。然而该技术需要很大的初始样本量，且外泌体的回收率较低，无法用于微量和珍贵样品的外泌体分离和分析。因此，研究人员开发出了基于聚乙二醇(PEG)沉淀原理的外泌体分离方法。与超速离心相比，PEG沉淀技术能够处理大量样本，对初始样品量的需求少，回收率高。但是该技术存在其他非外泌体污染物的共沉淀，例如蛋白质和聚合物材料，因此其纯度仍有待提高。其他外泌体分离技术如尺寸排阻、透析、免疫磁珠和微流控等往往工艺复杂，通量低、样本需求量大，纯度仍没有明显提高。因此，开发一种新型的具有初始样品需求量小的高纯度外泌体富集新方法十分必要。

作为一种新型的人工抗体制备技术，分子印迹技术通过人工设计和合成具有特定结构和功能的分子识别材料，融合了化学识别和形状匹配两种作用，能够实现复杂样品中目标分子的高特异性识别。以外泌体为模板制备的外泌体印迹材料有望用于外泌体的分离、富集和纯化。但是，目前较纯的外泌体难以获得且脆弱，无法直接用作模板，因此目前还未有直接将外泌体用作模板制备外泌体印迹材料的相关报道。

ζ-电位分析结果表明，外泌体表面具有电负性，能够与带正电荷的分子发生相互作用。另外，由于外泌体尺寸介于40-100nm之间，相对于其他干扰蛋白，具有独特的尺寸分布范围，因此结合静电原理和空间结构效应的协同作用有望成为外泌体富集的新方法。因此，基于外泌体的表面带电性和特殊的尺寸，使用与外泌体尺寸分布相似、表面电性互补的纳米颗粒作为替代模板，制备得到一种替代模板印迹聚合物，从而实现复杂样品中外泌体的分离、富集和纯化。

发明内容

本发明的目的是提供一种对食品、血液、尿液、脑脊液、精液、组织液、淋巴液、唾液、乳汁或细胞培养液中的外泌体具有特异性识别能力的替代模板印迹材料的制备和应用方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物，可按以下步骤制备获得：

(1)将粒径分布在40-100nm的替代模板超声分散于致孔剂中制备成替代模板分散液，替代模板与致孔剂的质量比为0.5-2:0.5-5，其中替代模板为二氧化硅纳米颗粒或聚苯乙烯纳米颗粒、聚乳酸纳米颗粒、聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒中的一种或二种以上，致孔剂为水、二甲基亚砜、乙腈、甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的一种或二种以上；