[发明专利]一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒

说明书

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS‑CoV的引物和试剂盒，本发明本发明通过设计利用该引物和探针可特异性扩增出来SADS‑CoV，实时荧光RT‑RPA可通过实时监测扩增过程中探针与扩增片段特异性结合的情况，使用轻便的荧光检测仪，采集荧光数据，利用所述方法进行扩增后即可鉴别SADS‑CoV，准确性高、特异性强，重复性好；可以准确、快速、高效地进行SADS‑CoV检测，不需昂贵复杂的仪器，为猪急性腹泻综合征冠状病毒的流行病学检测和安全生产提供了新的技术手段，大大缩短了检测时间，有利于现场疫情快速诊断和监控，性价比高，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体的，涉及一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和试剂盒。

背景技术

猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是一种新型冠状病毒，可引起严重的猪急性腹泻综合征(Swine acute diarrheasyndrome，SADS)。SADS-CoV主要引起仔猪的水样腹泻，剧烈呕吐、消瘦和脱水，其中5日龄以下感染仔猪死亡率达90％，8日龄以上感染仔猪死亡率低于5％。研究发现SADS-CoV不与目前猪场流行的3种冠状病毒：猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)的抗体发生交叉反应，因此现有的猪冠状病毒疫苗对SADS-CoV感染可能无效，一旦大规模暴发可能会给养殖业带来严重的经济损失。

SADS-CoV是甲型冠状病毒属成员，具有典型的冠状病毒结构，病毒表面有突起，直径为100～200nm，基因组为单股正链RNA，全长约27.17kb，包括5′-UTR、3′-UTR，有5个非结构蛋白(ORF1a、ORF1b、NS3a、NS7a、NS7b), 4个结构蛋白包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)。目前，应用于SADS-CoV的诊断方法主要为：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，荧光定量PCR，免疫荧光染色，病原分离鉴定等。以上检测手段，特异性和灵敏性均具有优势，但是这些检测方法的实施需要专业的人员操作，高价的检测设备且检测周期长，因此技术要求相对较高，无法推广使用。而即时检测(Point of care testing，POCT)可以借助小型的桌面式设备或试剂对疾病进行现场快速诊断，具有快速、便捷，检测成本低等优点，近年来各种POCT检测产品逐步在市场推广并被接受。

现有技术还没有检测SADS-CoV的POCT检测产品。

发明内容

针对上述现有技术中存在的现有技术还没有检测SADS-CoV的POCT检测产品的技术缺陷，本发明首先提供了一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和探针。

本发明的第二个目的是提供上述引物和探针在制备特异性检测 SADS-CoV荧光RT-RPA的检测试剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供含有上述引物和探针的荧光RT-RPA试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种基于实时荧光逆转录重组酶聚合酶核酸扩增技术检测SADS-CoV的引物和探针，所述引物包括上游引物F和下游引物R，所述上游引物F和下游引物R的序列如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述探针的组成为：5’端序列(THF)3’端序列(C3-spacer)。