[发明专利]一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒，其特征在于：包括：能够特异性识别牛奶酪蛋白的第一抗体、能够特异性识别牛奶酪蛋白且与第一抗体结合位点不同的第二抗体、牛奶酪蛋白、纳米金溶液、AgNO3溶液、对苯二酚溶液和TMB溶液即3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；所述第一抗体浓度为0.1~0.5 μg/mL；第二抗体浓度为0.1~0.5 μg/mL；牛奶酪蛋白浓度为100 μg/mL；AgNO3溶液浓度为1mM；对苯二酚溶液浓度为1 mM，TMB溶液浓度为40 mmol/L；纳米金溶液浓度为75 mg/mL，纳米金的粒径为15~20 nm；

纳米金溶液与第二抗体制备纳米金-第二抗体探针；将第一抗体、系列浓度牛奶酪蛋白和纳米金-第二抗体探针结合并加入AgNO3溶液和对苯二酚溶液，孵育，以形成@Ag/Au结构；

第一抗体捕获酪蛋白，@Ag/Au标记第二抗体特异性识别酪蛋白；在@Ag/Au的催化作用下，H₂O₂与TMB反应呈现蓝色，加入H₂SO₄终止反应后呈现黄色。

2.使用权利要求1中所述的一种牛奶致敏原的比色检测试剂盒的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、制备纳米金-第二抗体探针：于量筒中量取48.75 mL去离子水于洁净的锥形瓶中，温和搅拌下加入1.25 mL 4 g/L HAuCl4储备液；280 ℃下高温搅拌至溶液沸腾，保持沸腾2-3min后加入2.0 mL10 mg/mL柠檬酸钠溶液，并增加磁力搅拌转速；待溶液颜色稳定后停止加热，并将反应完成的纳米金溶液置于磁力搅拌器上继续搅拌冷却至室温，即可制得15 nm纳米金粒子溶液；将获得的纳米金溶液于室温1000 rpm条件下离心10 min，过滤去除部分聚集沉降的金粒子，将过滤获得的纳米金粒子溶液储存于4 ℃待用；吸取1 mL纳米金粒子溶液于2 mL离心管内，加入0.1 mol/mL K2CO3溶液条件体系pH至8.5；将pH 为8.6，10 mmol/L的第二抗体用PBS 缓冲液稀释至0.3 μg/mL，加入10 μL第二抗体，所述第二抗体为牛奶致敏原特异性单抗，室温下孵育60 min，使得第二抗体吸附在纳米金颗粒上；加入10 µL 500µg/mL BSA即牛清蛋白，室温下孵育60 min，以封闭纳米金的非特异性结合位点，于4℃下10000 g离心10 min，小心移去上清液；用含有0.5% BSA的pH为7.4的0.5× PBS缓冲液将沉淀复溶，即得到纳米金-第二抗体探针；

b、依次将第一抗体、系列浓度牛奶酪蛋白和纳米金-第二抗体探针结合在酶标板上；第一抗体的浓度为0.1~0.15μg/mL，第一抗体也为牛奶致敏原特异性单抗且与第二抗体结合位点不同；

c、依次往b步骤上的酶标板上加入AgNO3溶液和对苯二酚溶液，孵育，以形成@Ag/Au结构；AgNO3溶液浓度为1 mM；对苯二酚溶液浓度为1 mM；

d、依次往c步骤上的酶标板上加入H2O2溶液和TMB溶液，显色后，加入H2SO4终止反应，肉眼观察进行定性检测，在450 nm处测定吸光度，进行定量检测；H2O2溶液为100 µL/well的9 M H2O2溶液；TMB溶液浓度为40 mmol/L。

3.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述a步骤中第二抗体的浓度为0.1 μg/mL。

4.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述a步骤中纳米金的粒径为15~20 nm。

5.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述b步骤中第一抗体的浓度为0.1μg/mL。

6.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述c步骤中孵育时间为10~15 min。

7.根据权利要求2中所述的一种牛奶致敏原的比色检测方法，其特征在于：所述d步骤中反应时间为1~2 min。